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Título

Genetic baculovirus determinants for pathogenicity, virulence and transmission

AutorSerrano, Amaya
DirectorMuñoz, Delia ; Caballero, Primitivo
Fecha de publicaciónfeb-2015
EditorUniversidad Pública de Navarra
CSIC-GN-UPNA - Instituto de Agrobiotecnología (IDAB)
ResumenLos baculovirus se vienen utilizando desde hace tiempo como agentes de control biológico contra lepidópteros, dípteros e himenópteros debido a su eficacia, alta especificidad y seguridad frente a organismos que no son el objeto del tratamiento. El nuclepoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua (SeMNPV) tiene un estrecho rango de huésped y solo afecta a larvas de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Los aislados naturales del SeMNPV están compuestos de mezclas de genotipos que se creen que son importantes para la supervivencia del virus. La amplificación de SeMNPV en cultivo celular conduce a una rápida perdida de infectividad in vivo asociada con la selección preferente de genotipos con grandes delecciones. Esta tesis se centra en la caracterización biológica del baculovirus de Spodoptera exigua para mejorar nuestro conocimiento sobre el papel de la diversidad genotípica y sobre la implicación de genes individuales en patogenicidad, virulencia y transmisión. Avances en la tecnología de secuenciación de ADN y los más bajos costes de la misma han facilitado la identificación de genes virales que pueden jugar un papel importante en el proceso de infectividad del SeMNPV. En un estudio previo la secuenciación y comparación de 7 genotipos diferentes del SeMNPV con diferentes propiedades insecticidas, como la virulencia y la patogenicidad, permitieron la identificación de algunos ORFs como genes candidatos que pueden tener un efecto en esas propiedades insecticidas: se4, se5, se28, se76, se87 y se129 (Thézé et al., 2014). En el Capitulo 2 se construyó un sistema de recombinación basado en bacmidos utilizando el genotipo VT- SeAL1 para deleccionar individualmente los ORFs previamente identificados. La delección de se4, se5, se76 y se129 disminuyó la patogenicidad del virus comparado con el virus derivado del bacmido al insertar aislado silvestre, SeBacAL1. La delección del se87 no afectó la patogenicidad, mientras que la deleccion de se28 aumento ligeramente la patogenicidad. La delección individual de los genes se4, se28, se76, se87 y se129 no afectó la virulencia del virus, aunque la delección de se5 retrasó el tiempo de mortalidad alrededor de 7 horas. Interesantemente, el genotipo silvestre SeAL1 mostró ser ligeramente menos virulento que el bacmido SeBacAL1, lo cual puede ser debido a la inserción del plásmido de clonaje en la región intergénica del se27 y se28 del genoma de SeAL1. En conjunto, la deleccion de se5 mostró los efectos más significativos en las propiedades insecticidas estudiadas del SeMNPV, con un descenso en la patogenicidad de casi 10 veces y un retraso en el tiempo de mortalidad de 7 horas, comparado con el virus derivado del SeBacAL1.
Un estudio previo sobre la ecología del SeMNPV reveló que el genotipo designado VT-SeAL1 produjo un 100% de infecciones encubiertas en adultos que habían sobrevivido a un tratamiento con OB en el estadio larvario. En cambio, otro genotipo designado HT-SeG25 solo produjo un 16% de infecciones encubiertas. Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que algunos genotipos de SeMNPV pueden estar asociados con una ruta de transmisión vertical del virus, mientras otros genotipos pueden estar asociados a una ruta de transmisión horizontal. La comparación de genotipos de transmisión vertical con genotipos de transmisión horizontal, Thézé et al. (2014) permitió identificar tres ORFs que pueden estar envueltos en la transmisión vertical del virus: se5, se96 y se99. En el Capítulo 3 el sistema de recombinación de bacmidos desarrollado en el Capítulo 2 se utilizó para deleccionar estos ORFs y comprobar el efecto sobre la capacidad de transmisión vertical del virus. Larvas de Spodoptera exigua fueron infectadas sub-letalmente con una concentración equivalente a la CL40 y las infecciones sub-letales fueron detectadas en adultos mediante PCR cuantitativa (Q-PCR). El análisis no mostró diferencias significativas en el número de adultos que adquirieron una infección persistente con ninguno de los virus, lo que sugiere que dichos genes no están involucrados en la transmisión vertical del virus o, si lo están, lo hacen conjuntamente con otros genes. Las estructura genotípica de diferentes aislados silvestres de SeMNPV es muy similar a la composición genotípica de una población natural del SfMNPV. Las poblaciones de ambos baculovirus se caracterizan por la presencia de diferentes genotipos con delecciones en la misma región del genoma, la comprendida entre el se12 y el se40 en el caso de SeMNPV, y entre sf20 y sf36 en el caso de SfMNPV. En dichas regiones se localizan importantes genes: cathepsin, chitinase, gp37, ptp2, egt, pkip, arif1, pif1, pif2 y fgf, así como algunas ORFs de función desconocida. En el Capitulo 4 la estructura genotípica de los aislados SeUS2, SeUS1 y SfNIC fue comparada para determinar los mecanismos de acción evolutivos y ecológicos de estas estructuras genotípicas poblacionales tan similares.
El alineamiento de las secuencias que flanquean a los puntos de delección de los diferentes genotipos indicó que se trata de un mecanismo de evolución independiente que genera y mantiene los genotipos en las respectivas poblaciones de estos virus. El aislamiento de un genotipo deleccionado y los estudios de complementación con diferentes mezclas de genotipo deleccionado y completo, claramente demostró una interacción entre los genotipos en la población viral. El genotipo deleccionado SeUS2-C tuvo una ventaja replicativa en cultivo celular, ya que estaba presente en un 81% de las placas aisladas en cultivo celular después de la inoculación de hemolinfa extraída de larvas infectadas con SeUS2-WT. Sin embargo, el genotipo completo SeUS2-A solo se encontró presente en un 19% de las placas. La presencia de una alta concentración de SeUS2-C en OBs co-ocluidos con el genotipo completo SeUS2-A comprometió severamente la patogenicidad del virus. Interesantemente, la prevalencia del genotipo SeUS2-C fue solo del 25% en el aislado silvestre SeUS2, comparado con el 81% de placas aisladas en cultivo celular. Se cree que los genotipos deleccionados se han generado debido a funciones importantes en la transmisibilidad del virus y que la diversidad genotípica del virus está estructurada para maximizar la probabilidad de transmisión. El aislado SeMNPV-US1 está también compuesto por varios genotipos, muchos de los cuales llevan delecciones de tamaño variable en la región del genoma comprendida entre el se15y el se41. En el Capítulo 5 se generaron bácmidos que contenían el genoma completo de SeMNPV (SeBac10) y un genotipo natural con una deleccion de 9.5Kb (SeBac72). El SeBac72 mostró una proliferación viral más eficiente en células de S. exigua que el genotipo completo SeBac10, lo cual concuerda con lo que se encontró el Capítulo 4. La secuenciación de SeBac72 puso de manifiesto que los genes se16- se28 estaban afectados por la deleccion. El análisis de diferentes delecciones de ORFs individuales del bácmido SeBac10, permitió identificar al se28 como el gen responsable de prevenir la proliferación de SeMNPV en cultivo celular. Sin embargo, la expresión de se28 en un bácmido de Autographa califórnica MNPV, un virus heterólogo que pertenece al grupo I de los Alphabaculovirus, no bloqueó la proliferación viral. Sorprendentemente, el silenciamiento de se28 mediante RNAi en el genotipo completo SeBac10 no condujo a un aumento de la propagación del virus en cultivo celular, sugiriendo que no es el transcrito ni la proteína, sino la secuencia de ADN y/o la secuencia topológica de se28 lo que determina la proliferación viral. La comparación de la secuencia de la región se27-se30 del genoma de SeMNPV con la región ac15-ac18 del genoma de AcMNPV mostró un 43% de homología a nivel de ADN, aunque la secuencia de aminoácidos de se28 y ac16 (DA26) no son homólogas. Ambos genes se28/ac16 son parte de regiones hipervariables asociadas con inserciones/delecciones. En conjunto, la región del gen se28 ha sido identificada como un regulador clave en la propagación del virus y se cree que puede ser responsable de la variación genotípica encontrada en los aislados naturales de baculovirus. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis profundizan nuestro conocimiento en la diversidad genética y genotípica de SeMNPV, y de los baculovirus en general, y puede ayudar en el futuro a la mejora de las estrategias de control biológico basadas en baculovirus.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/142449
Aparece en las colecciones: (IDAB) Tesis
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