NMR and molecular dynamics studies on the molecular recognition of carbohydrates by proteins

Abstract

[EN] The recognition of carbohydrates by lectins (proteins that selectively recognize carbohydrates without enzymatic or immunological activity) is a ubiquitous event in living organisms. Indeed, they mediate a variety of key biological processes. For this reason, the interest to study carbohydrates from this perspective has increased in the last years. From the structural viewpoint, a number of biophysical techniques have been employed to obtain detailed information about these essential molecular recognition processes. In particular, we have stressed the combined use of NMR experiments with MD simulations and molecular modeling protocols as key tool to dissect, at atomic resolution, the key binding elements of biomedical relevant ligands at their specific receptor surfaces. Thus, in this thesis, we have employed a combination of STD, trNOESY-NMR and MD simulations as a powerful tool to provide important information about the molecular recognition of synthetic oligosaccharides towards two specific IgG C7-37 and IgM G19-2 antibodies. Our study has provided experimental evidences on the individual importance of the different residues, depending on its position at the oligosaccharide sequence, also for longer oligosaccharides, and their relevance for the molecular recognition process. The information obtained from STD-NMR experiments have evidenced the direct involvement of residue RhaC followed by its neighbor residues (RhapB-RhapC-GlcNAcpD) in every synthetic oligosaccharide in the presence of both mAbs. trNOESY-NMR experiments have also provided structural information on the major Φ/Ψ values for each glycosidic linkage, as well as the existing conformational equilibrium in the bound state. This equilibrium has been compared to that existing in the free state. The obtained data have indicated that these molecular recognition processes involve conformational selection processes. The analysis of the obtained molecular surfaces for the bound conformers showed that the major non-polar areas of the ligand are close to the antibody surface.

When large N-glycans interact with lectins, the nature of the target epitope strictly depends on the nature of the tested lectin, which can select distinct determinants of the complex-type N-glycan saccharide chain with exquisite specificity, depending on the relative presentation of the different residues and the architecture of the binding site. We have underscored the importance of the coexistence of binding sites from different lectin domains for achieving glycan binding by comparing a single hevein domain and WGA, a tetramer. The monomeric unit does not recognize the large glycan, with the branching at the βMan residue being the key structural element for precluding the interaction. In contrast, the multidomain lectin WGA binds the terminal reducing end of either non- or sialylated-N-glycan owing to the possibility of achieving additional intersite stabilizing interactions from one of the neighboring hevein domains. Work with VAA has yielded insights into how α2,6-sialylation can be accommodated by this lectin, providing enhanced binding in natural N-glycans when compared to the non-sialylated LacNAc-terminated analogue. The results for the MAL–MAH mixture have permitted definition of the role of the α2,6-linked sialic acid residue in blocking binding of the corresponding sialylated-N-glycan. The binding to the LacNAc terminus of the nonsialylated- N-glycan is detectable, providing the control reference for positive binding. Also in this thesis, we have demonstrated the capability of four oligosaccharides related to the glycotope antigen (related to immunodeficiency processes) to interact with different scFv glycotope-binding antibody fragments. Using STD-NMR experiments, we have shown that the presence of 3-O-α-DGal A’ moiety is decisive for the binding process.

Finally, we have also shown that a variety of lactose- and 6’sialyllactosefunctionalized glycodendrimers can be easily accommodated by Viscumin, a model toxic lectin, providing enhanced binding. NMR experiments assisted by molecular modeling permitted the identification of the key sugar-lectin binding features. The modeling protocol has permitted to suggest a structural model for the possible multivalent interactions of these ligands with this lectin.

[ES] El reconocimiento de carbohidratos por lectinas (proteínas que selectivamente reconocen carbohidratos sin actividad enzimática o inmunológica) es un suceso ubicuo en los organismos vivos. De hecho, median variedad de procesos biológicos clave. Por esta razón, el interés por estudiar carbohidratos desde esta perspectiva ha aumentado en los últimos años. Desde un punto de vista estructural, una gran cantidad de técnicas biofísicas han sido empleadas para obtener información detallada acerca de éstos procesos de reconocimiento molecular esenciales. En particular, hemos destacado el uso combinado de experimentos de RMN con simulaciones de Dinámica Molecular y protocolos de modelado molecular como herramientas clave para diseccionar, a escala atómica, los elementos de unión clave de ligandos relevantes desde un punto de vista biomédico en sus superficies del receptor específico. Por consiguiente, en esta tesis, hemos empleado una combinación de RMNSTD, trNOESY y simulaciones de dinámica molecular como poderosas herramientas para obtener información importante acerca del reconocimiento molecular de oligosacáridos sintéticos frente a dos anticuerpos específicos IgG C7-37 e IgM G19-2. Nuestro estudio ha dado evidencias experimentales de la importancia individual de los diferentes residuos, dependiendo de su posición en la secuencia oligosacarídica, también para oligosacáridos mas extensos, y su relevancia en el proceso de reconocimiento molecular. La información obtenida a partir de los experimentos de RMN-STD evidenció la directa implicación del residuo de RhaC seguido por sus residuos vecinos (RhapB-RhapC-GlcNAcpD) en todos los oligosacáridos sintéticos en presencia de ambos anticuerpos. Experimentos de RMN-trNOESY también dieron información estructural de los valores de Φ/Ψ mayoritarios para cada enlace glicosídico, además de el equilibrio conformacional existente en el estado unido. Este equilibrio ha sido comparado con el existente en el estado libre. Los datos obtenidos han indicado que estos procesos de reconocimiento molecular conllevan una selección conformacional. El análisis de las superficies moleculares obtenidas para los confórmeros acomplejados mostró que las mayoritarias áreas no-polares del ligando están cerca de la superficie del anticuerpo.

Cuando los N-glicanos interaccionan con lectinas, la naturaleza del epítopo objetivo estrictamente depende de la naturaleza de la lectina estudiada, pudiendo seleccionar distintos determinantes de la cadena sacarídica del N-glicano con exquisita especificidad, dependiendo de la presentación relativa de los diferentes residuos y de la arquitectura del sitio de unión. Hemos enfatizado la importancia de la coexistencia de sitios de unión de diferentes dominios de lectina para conseguir unión al glicano comparando un dominio único de heveina y WGA, un tetrámero. La unidad monomérica no reconoce el extenso glicano, con la ramificación en el residuo de βMan siendo el elemento clave de descarte de la interacción. Por el contrario, la lectina multidominio WGA se une al extremo reductor de ambos N-glicanos sialilado y no sialilado admitiendo la posibilidad de obtener interacciones estabilizantes entre-sitios de uno de los dominios de heveína vecinos. Mediante estudios con VAA se obtuvo información acerca de cómo la α-sialilación 2,6 puede ser acomodada por esta lectina, generando un incremento de la unión en N-glicanos naturales cuando lo comparamos con el N-glicano no sialilado correspondiente. La unión al extremo terminal LacNAc del N-glicano sialilado es detectable, obteniéndose la referencia control para la unión positiva. También en esta tesis, hemos demostrado la capacidad de cuatro oligosacáridos relacionados con antígeno glycotope (relacionado con procesos de respuesta inmune) de interaccionar con diferentes fragmentos de anticuerpo scFv que se unen al glycotope. Usando experimentos de STD, hemos demostrado que la presencia del residuo 3-O-α- DGal A’ es decisiva en el proceso de unión. Finalmente, también hemos demostrado que una variedad de glicodendrímeros funcionalizados con lactosa y con 6’sialil-lactosa pueden ser fácilmente acomodados por Viscumina (una lectina modelo tóxica) mejorando la unión. Experimentos de RMN asistidos por modelado molecular permitieron la identificación de los rasgos de unión clave entre el azúcar y la lectina. El protocolo de modelado ha permitido sugerir un modelo estructural de las posibles interacciones multivalentes de estos ligandos con esta lectina.