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Identificación, expresión y caracterización de peroxidasas ligninolíticas de interés en genomas de basidiomicetos

AuthorsFernández-Fueyo, Elena
AdvisorMartínez, Angel T.; Ruiz-Dueñas, F.J.
Fungal genomes
Structure-function relationships
Protein engineering
Lignin degradation
Issue Date2014
PublisherCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Abstract[EN] The sequenced genomes of P. ostreatus and C. subvermispora allowed us to investigatethe biochemical, structural and operational properties of the different ligninolytic hemeperoxidases present in two model fungi of biotechnological interest, due to theirability to degrade lignin preferentially when growing on lignocellulosic substrates. The kinetic constants of the different class-II peroxidases (of the superfamily of plantfungal-prokaryotic peroxidases) from the P. ostreatus genome, after their heterologous expression in Escherichia coli, revealed a repertoire formed by three VPs and six MnPs and confirmed the absence of LiP, which until now has been associated with the ability of white-rot fungi to degrade lignin. The study also showed for the first time the presence in a MnP of the conserved catalytic tryptophan that oxidizes the bulky lignin polymer at the surface of VPs and LiPs. This anomaly was explained by a natural mutation in peroxidase evolution that interrupts the electron transfer pathway from the surface to the activated heme cofactor, as shown by reversed mutagenesis. The structural-functional study of the six MnPs revealed that they correspond to a novel subfamily characterized by their Mn-independent activity on some substrates and the presence of a C-terminal tail shorter than in typical (long) MnPs from Phanerochaete chrysosporium. One member of this new subfamily has been crystallized, being the first short MnP crystallized to date. Moreover, studies using 14C-labeled lignin and model dimers showed for the first time the lignin degrading ability of VPs. The above results confirm that VP plays in P. ostreatus and other species of Agaricales the role of LiP in P. chrysosporium and other species of the order Polyporales. In general the different MnP and VP isoenzymes from P. ostreatus genome present slightly differences in their catalytic constants but, surprisingly, they show significant differences in their stability against temperature (with T50 values of 43-63 ºC, after 10 min at pH 5) and pH (with residual activities of 0-96% at pH 3 and 0-57 % at pH 9, after 4 h at 4 ºC). To take advantage from all the above findings, the two isoenzymes from the P. ostreatus genome with the highest thermal and pH stabilities were crystallized, with the aim of identifying the structural bases of the above properties. The high abundance of basic residues and salt-bridge/H-bond interactions at the surface of the protein was related to the high stability of one of these peroxidases, as confirmed by directed mutagenesis. To investigate the biological meaning of these differences, specific primers were designed for each isoenzyme and their differential transcription was analyzed by quantitative PCR, by varying the temperature and pH conditions of cultures grown in a lignocellulose medium, combined with secretomic and activity studies. Although the genes of some of the most stable isoenzymes showed higher relative transcription levels at the most extreme temperature and pH conditions assayed, no correlation between the transcriptomic and secretomic results was observed for the most expressed MnP gene. This was due to impaired secretion as shown by the abundance of this isoenzyme in the intracellular proteome.
These results showed the environmental regulation of isoenzyme gene expression, but also evidenced the need for careful studies to establish correlations between transcriptomic data and production of extracellular enzymes by these fungi. Although P. chrysosporium has been the model ligninolytic fungus for years, the simultaneous degradation of wood lignin and polysaccharides prevents its use in biotechnological applications, where the use of cellulose is intended. In contrast, C. subvermispora is a selective lignin degrader of interest in wood delignification (similar to Pleurotus species in delignification of agricultural wastes) but its production of lignin-degrading peroxidases (LiPs and VPs) remained unknown. The sequenced C. subvermipora genome revealed an unusually high number of MnPs, together with genes implicated in the synthesis of unsaturated fatty acids, suggesting their contribution in lignin degradation via free radicals derived from lipid peroxidation. However, in the C. subvermispora genome two genes of one putative VP and one putative LiP were also found. These genes were heterologously expressed, the obtained proteins were biochemically characterized and, as in the case of P. ostreatus peroxidases, their ability to degrade lignin was demonstrated using a radiolabeled model dimer and synthetic lignin. These studies confirm that these two new identified genes in C. subvermispora genome correspond to functionally competent LiPs, which probably represent VP-to- LiP transitional forms. This conclusion was based on the kinetics constant on aromatic substrates and the inability to oxidize Mn2+ of the enzyme initially identified as a VP. This enzyme presents an hypothetical Mn2+-oxidizing site (formed by three acidic residues close to the internal heme propionate) which was non-functional due to the presence of a neighbor forth acidic residue (absent in VPs and MnPs) as demonstrated by site directed mutagenesis.
In addition to the above mentioned short and long MnP subfamilies, a new subfamily of the so-called extralong MnPs has been distinguished in recent surveys of basidiomicete genomes. The three different MnP types share a Mn-binding site, but it has been suggested that they would differ in their catalytic and stability properties. Interestingly, the genome of C. subvermispora revealed the joint presence of short, long and extralong MnPs (in addition to the above mentioned LiPs) offering a unique opportunity to compare the three proposed subfamilies. After their heterologous expression, we performed a biochemical and structural characterization, together with directed mutagenesis studies of the C-terminal tail. This tail is located at the vicinity of the conserved Mn-oxidation site and its removal from extralong and long MnPs confers them the Mn-independent activity characteristic of short MnPs. It was concluded that the short forms represent a true MnP subfamily, whose different catalytic and stability properties are related to the presence of the tail, while the so-called long and extralong MnPs did not show enough differences to be classified as two separate subfamilies. A highly stable extralong MnP (maintaining its activity at pH 2, which inactivate other peroxidases) was crystallized and its structure was solved at 1.2 Å, being the first extralong MnP crystallized to date. After its structural-functional characterization, this MnP was used as a robust scaffold to obtain stable high redox-potential peroxidases of biotechnological interest, by introducing an exposed catalytic tryptophan. This enzyme was able to act at extremely acidic pH that increases its oxidizing power against recalcitrant aromatic compounds but inactivates wild-type LiPs and VPs. The results obtained in this thesis have allowed to establish the existence of LiP type enzymes in C. subvermispora and confirm their absence in P. ostreatus, where they are substituted by VPs. On the other hand, the first structural-functional characterization of short-MnP has been performed and the results obtained for long and extralong MnPs show that they do not present enough differences to be classified as two different peroxidase subfamilies.
[ES] La secuenciación de los genomas de Pleurotus ostreatus y Ceriporiopsis subvermispora nos ha permitido investigar las propiedades bioquímicas, estructurales y operacionales de las diferentes hemoperoxidasas ligninolíticas presentes en dos hongos modelo de interés biotecnológico, por su capacidad para degradar preferentemente la lignina frente a la celulosa en diferentes sustratos lignocelulósicos. Las constantes cinéticas de las diferentes peroxidasas de clase-II (de la superfamilia de peroxidasas vegetales-fúngicas-procariotas) del genoma de P. ostreatus, tras su expresión heteróloga en Escherichia coli, revelan un repertorio formado por tres peroxidasas versátiles (VPs) y seis manganeso peroxidasas (MnPs), confirmando la ausencia de lignina peroxidasa (LiP), a la que hasta ahora se ha asociado la capacidad para degradar la lignina, en los hongos ligninolíticos. Este estudio muestra por primera vez la presencia en una MnP del triptófano catalítico superficial conservado en todas las VPs y LiPs. Esta anomalía se explica por una mutación durante la evolución de estas peroxidasas que interrumpió la vía de transporte electrónico desde la superficie hasta el grupo hemo, como se demostró por mutagénesis dirigida reversa. Los estudios estructurales-funcionales de las seis MnPs de P. ostreatus revelan que éstas constituyen una nueva subfamilia, caracterizada por su actividad independiente de Mn sobre algunos sustratos y por la presencia de una cola en el extremo C-terminal más corta que en las típicas MnPs largas de P. chrysosporium. Se ha cristalizado un miembro de esta nueva subfamilia, siendo la primera MnP corta cristalizada. Además, usando dímeros modelo y lignina sintética marcados radioactivamente se ha mostrado por primera vez la capacidad de las VPs para degradar la lignina. Estos resultados confirman que la VP desempeña en P. ostreatus y en otras especies de agaricales el papel desempeñando por la LiP en P. chrysosporium y otras especies de poliporales. En general las diferentes isoenzimas de MnP y de VP del genoma de P. ostreatus no presentan grandes diferencias en sus constantes catalíticas pero, sorprendentemente, si muestran grandes diferencias en su estabilidad a la temperatura (con valores de T50 de 43-63 ºC, tras 10 min a pH 5) y al pH (con actividades residuales de 0-96% a pH 3 y de 0-57% a pH 9, en ambos casos tras 4 h a 4 ºC). La isoenzima más estable al pH y la más estable a la temperatura de P. ostreatus se cristalizaron y su estructura fue resulta a 1.0-1.1 Å para intentar identificar las bases estructurales de estas propiedades.
La mayor abundancia de residuos básicos, y de puentes de hidrogeno e interacciones salinas, en la superficie de la proteina se relaciona con la estabilidad de una de estas peroxidasas, como se ha confirmado en estudios posteriores de mutagénesis dirigida. Para investigar el significado biológico de la duplicación de genes y la existencia de múltiples MnPs y VPs, se diseñaron cebadores específicos para cada isoenzima y se analizaron por RTqPCR las diferencias de expresión cuando se modifican las condiciones de temperatura y pH en cultivos de P. ostreatus sobre material lignocelulósico, en combinación con estudios proteómicos y medidas de actividad. No se encontró una correlación entre los resultados secretómicos y de transcripción de la isoenzima más expresada, debido a una secreción deficiente puesta de manifiesto mediante la comparación del secretoma y el proteoma intracelular. Sin embargo, los genes de algunas de las enzimas más estables mostraron niveles de transcripción relativa mayores en las condiciones más extremas de pH y temperatura ensayadas. Estos resultados muestran una regulación ambiental de la expresión de las isoenzimas, pero también ponen de manifiesto la necesidad de realizar estudios cuidadosos para establecer relaciones entre los datos transcriptómicos y la producción extracelular de enzimas por estos hongos.
Aunque Phanerochaete chrysosporium ha sido durante años el hongo ligninolítico modelo, su patrón de degradacion simultanea de la lignocelulosa, impide su uso en aplicaciones biotecnológicas donde se busca el aprovechamiento de la celulosa. Por el contrario, C. subvermispora es un degradador selectivo de interés en la deslignificacion de la madera (como las especies de Pleurotus en la deslignificación de residuos agricolas) pero en sus cultivos nunca se habían identificado peroxidasas degradadoras de lignina, como LiP y VP. La secuenciación del genoma de C. subvermipora mostró un número inusualmente elevado de MnPs, junto con genes implicados en la síntesis de ácidos grasos insaturados, lo que sugirió su contribución en la degradación de la lignina a traves de los radicales derivados de la peroxidación de los lípidos. Sin embargo, en el genoma de C. subvermispora también se identificaron dos genes de una putativa LiP y una putativa VP. Estos genes se expresaron, las proteínas obtenidas se caracterizaron bioquímicamente y, al igual que en el caso de P. ostreatus, se determinó su capacidad de degradar directamente la lignina usando dímeros modelo y lignina sintética marcada radioactivamente. Estos estudios confirman que los dos nuevos genes identificados en el genoma de C. subvermispora corresponden a LiPs funcionales, que posiblemente representan formas de transición entre VP y LiP. Esta última conclusión se deduce de la incapacidad de oxidar Mn2+ y de las constantes cinéticas sobre sustratos aromáticos por parte de la enzima inicialmente identificada como VP. Esta enzima presenta un sitio hipotético de oxidación de Mn2+ (constituido por tres residuos ácidos junto al propionato interno del hemo) que resultó ser no-funcional por la presencia de un cuarto residuo ácido contiguo (ausente en VPs y MnPs) tal como se mostró mediante mutagénesis dirigida.
En los últimos estudios de los genomas de basidiomicetos se ha diferenciado una nueva subfamilia de MnPs, además de las MnP de tipo corto y largo mencionadas anteriormente, que se han denominado MnP extralargas. Estos tres tipos de MnPs comparten el sitio de unión del Mn, y se ha sugerido que presentarían propiedades catalíticas y de estabilidad diferentes. Los tres tipos de MnP están presentes en el genoma de C. subvermispora, lo que ha supuesto una oportunidad única para comparar las tres subfamilias propuestas, sin las interferencias derivadas de diferentes historias evolutivas (en diferentes hongos). Tras su expresión heteróloga, se caracterizaron bioquímica y estructuralmente y se realizaron estudios de mutagénesis dirigida en la cola C-terminal. Esta cola se localiza próxima al sitio de oxidación del Mn y su eliminación confiere a las MnPs largas y extralargas la actividad independiente de Mn que caracteriza a las MnPs cortas. Estos estudios permitieron concluir que las MnP de tipo corto constituyen una subfamilia verdadera, con diferentes propiedades catalíticas y de estabilidad debidas a la presencia de una cola de tipo corto, mientras que las MnPs llamadas largas y extralargas no muestran suficientes diferencias para considerarse dos subfamilias diferentes. Una MnP extralarga extremadamente estable (que mantiene la actividad a pH 2, que inactiva a otras peroxidasas ligninolíticas) fue cristalizada y su estructura resuelta a 1.2 Å, siendo la primera peroxidasa de este tipo de la que se obtiene la estructura molecular. Tras su caracterización estructural-funcional, esta MnP se usó como una base "robusta" para, mediante la introducción de un triptófano catalítico, construir una peroxidasa de interés biotecnológico. Ésta es capaz de actuar a pH extremadamente ácido, lo que incrementa el poder oxidante sobre compuestos aromáticos recalcitrantes pero inactiva a las LiPs y VPs naturales. Los resultados obtenidos en la presente tesis han permitido establecer la existencia de enzimas de tipo LiP en C. subvermispora y confirmado su ausencia en P. ostreatus, donde estarían sustituidas por VPs. Por otro lado, aportan la primera caracterización estructural-funcional de las MnP cortas, y muestran que las descritas como MnPs largas y extralargas no presentan suficientes diferencias para establecer dos subfamilias.
Description227 p.-43 fig.-13 tab.-1 anexo con material suplementario
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