Desarrollo de metodologías analíticas que permitan el aislamiento y la determinación de flavinas de interés en la nutrición férrica de las plantas

Abstract

[ES] La deficiencia de hierro (Fe) es uno de los principales factores limitantes del rendimiento de los cultivos. Algunas especies de plantas consideradas tolerantes a la deficiencia de Fe acumulan en raíz y exportan a la rizosfera flavinas concretamente riboflavina (RF) y derivados sulfatados o hidroxilados de RF. La función de las flavinas como respuesta ante la deficiencia de Fe en plantas es todavía desconocida y su estudio exige de métodos analíticos selectivos que sean aplicables a matrices complejas como tejidos vegetales y medios de cultivo. La mayoría de los métodos analíticos desarrollados permiten determinar solo las flavinas más conocidas (RF y los cofactores FMN y FAD). Por ello el objetivo de este trabajo fue desarrollar un método que permita determinar todas las flavinas en materiales vegetales. Para ello se tomo como referencia un método recientemente desarrollado que utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada mediante una fuente de ionización por electrospray a un espectrómetro de masas de alta resolución (MS-TOF) consiguió determinar las flavinas producidas por plantas de alfalfa (Medicago truncatula) deficientes en Fe (7-COOH-RF, 7-OH-RF y 7-OH-RF) junto con RF, FMN y FAD. En este trabajo se optimizaron las condiciones de ionización obteniéndose señales más intensas de todas las flavinas y atenuando o eliminando su fragmentación en fuente ESI. Además, se obtuvieron unas condiciones cromatográficas que permiten por primera vez la separación de la mayoría de las flavinas (incluyendo las isobáricas RF 3’ sulfato, RF 5’ sulfato y FMN). Por último, el análisis mediante HPLC-ESI-MS(TOF) de extractos de raíz de plantas de remolachas y alfalfa deficientes en Fe y de las soluciones nutritivas permitió evaluar la aplicabilidad de algunas de las condiciones cromatográficas y de ionización desarrolladas en este trabajo a muestras reales.

[EN] Iron (Fe) deficiency is one of the major crop yield-limiting factors especially in plants grown on calcareous soils. Some plant species tolerant to Fe deficiency accumulate in root and exporte to rhizosphere flavins such as riboflavin (RF) and RF derivatives (e.g., RF 3’ sulfate and 7-hydroxyRF). The role of Fe-deficiency induced flavins in plant Fe-acquisition is still unknown. This study requires selective analytical methods that allow for the determination of flavins in complex matrices such as plant tissues. Most of the existing methods are devoted to the determination of the most known flavins (RF and the cofactors FMN and FAD). Therefore, the aim of this work was to develop a method for determining the most common flavins along with Fe-deficiency induced flavins in plant materials. For this purpose, we modified a method recently developed to identify the flavins (7-COOHRF, 7-OH-RF and 7-OH-RF) produced by Fe-deficient alfalfa (Medicago truncatula) plants by using high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a highresolution mass spectrometer (MS(TOF)) equipped with an electrospray ionization (ESI) source. An optimization of the ESI ionization conditions was carried out for each flavin in order to maximize the major ion signal and to decrease in source fragmentation. In addition, this is the first time that an HPLC method allowing for the separation of most of the flavins (including the isobaric flavins RF 3 ' sulfate, RF 5' sulfate and FMN) is described. Finally, some chromatographic and ionization conditions obtained in this work were tested in real samples analyzing nutrient solutions and root extracts from Fe-deficient sugar beet and alfalfa hydroponic cultures.