Estudio en modelos in vitro y ex vivo de los efectos inmunomoduladores del (1-3)-β-d-glucano sustituido en posición 0-2 producido por bacterias ácido lácticas

Abstract

[EN] Linear (1-3)-β-D-glucans containing (1-6) and (1-4) branches synthesised by plants and fungi are immunomodulators, and some of them are utilised for the preparation of functional foods. The exopolysaccharides (EPSs) synthesised and secreted by lactic acid bacteria (LAB) are polymers that have been extensively studied for a wide number of industrial applications, including pharmaceutical applications, and also for their role in mproving organoleptic properties in various fermented food. The enzyme glycosyltransferase GTF that occurs in a small group of LAB isolated from alcoholic drinks, synthesise (1-3)-β-D-glucans with substitutions at O-2. Previous studies have shown that this type of EPS has prebiotic properties and its presence enhances the adhesion of the producing LAB to the epithelial cells of the human intestine. However, their potential as immunomodulators had not, at that point, been investigated. The work presented here in this doctoral thesis focuses on two (1-3)-β-D-glucans with substitutions at O-2 that are synthesised by the LAB strains Pediococcus parvulus 2.6 (isolated from cider) and the recombinant Lactococcus lactis NZ9000[pNGTF] which expresses the GTF protein of P. parvulus 2.6. The EPSs have been extracted and purified from the culture supernatants by means of ethanol precipitation, chromatographic separation and dialysis. This produced samples of both EPSs that had no detectable contamination with DNA, RNA or protein, and were therefore suitable for immunological studies. The purified EPSs were then evaluated to determine their immunomodulatory and anti-inflammatory activities, using various in vitro and ex vivo models of human intestinal inflammation. An in vitro evaluation involved testing the effect of the EPSs against human pro-inflammatory macrophages derived from monocytes (M1) or from the THP-1 (PMA-THP-1) monocyte cell line. No cytotoxicity was observed and immunomodulatory events were detected in both types of macrophage. When the EPSs were co-V administered with the pro-inflammatory LPS of Escherichia coli, both caused an increase in the levels of secreted cytokines TNF-α, IL-12, p40 and IL-10, as well as an increase in the anti-inflammatory ratio of IL10/TNF-α. Furthermore, in M1 macrophages both EPSs altered the pattern of phosphorylation of various kinases, thereby activating routes of signaling of PI3K/mTOR/AKT, ErbB and of adherent unions. In a further in vitro model, based on inflamed human intestinal mucosa, the two EPSs were tested against human Caco-2 epithelial cells and PMA-THP-1 macrophages, in a transwell format. The EPSs caused no cytotoxicity against the Caco-2 cells. However, these polymers provoked changes in the expression profiles of TNF-α, IL10 and IL8 (at the protein level) and of TSLP, IL8 and IL10 (at the transcriptional level), thereby demonstrating a communication between the 2 cell-lines. Biopsy tissue from patients suffering from Crohn's disease was used as the basis of an ex vivo model. When treated with EPSs showed a potentially anti-inflammatory response, with alteration of the transcription of various regulatory mediators of NFkB.

Overall, the above models have shown that treatment with (1-3)-β-D-glucans with substitutions at O-2 produce stimulation of the immune system, thereby modulating the expression of cytokines and signaling routes that affect the processes of cell migration, proliferation and survival. Moreover, differences in effect were observed between the two EPSs used in these studies. Finally, the two purified EPSs were tested in in vitro salmonid models to determine their potential as antiviral agents as well as immunomodulators. When BF-2 fibroblasts (from Lepomis macrochirus) infected with infective pancreatic necrosis virus were treated with the EPSs there was no sign of cellular toxicity, rather, an inhibition of cytopathic damage, and a reduction of the viral titre. In an in vitro model using rainbow trout primary macrophages, the EPSs provoked the induction VI of the expression of the genes that code for the interferons IFN-I and IFN-γ, thus showing a stimulation of both the innate and adaptive immune responses. In summary, the results obtained in the course of this doctoral thesis show the potential of the (1-3)-β-D-glucans with substitutions at O-2 as immunomodulatory and anti-inflammatory agents, with possible future applications in functional foods or even possibly in veterinary or human medicine.

[ES] Los (1-3)-β-D-glucanos lineales y con ramificaciones (1-6) y (1-4) sintetizados por plantas y hongos son inmunomoduladores, y algunos de ellos se utilizan para la elaboración de alimentos funcionales. Los exopolisacáridos (EPSs) sintetizados y secretados por bacterias ácido lácticas (BAL) son polímeros extensamente estudiados por su amplia aplicación industrial, incluyendo la industria farmacéutica, y por jugar un papel primordial en las propiedades organolépticas de diversos productos fermentados. Además, la enzima glicosiltransferasa GTF de un grupo reducido de BAL aisladas de bebidas alcohólicas, sintetiza (1-3)-β-D-glucanos con sustituciones en O-2. Estudios previos han mostrado que este tipo de EPS tiene propiedades prebióticas, y su presencia contribuye a la capacidad de unión de la bacteria productora a células epiteliales del intestino humano. Sin embargo, su potencial como inmunomoduladores no había sido previamente investigado. En el presente trabajo de Tesis Doctoral se han producido dos (1-3)-β-D-glucanos con sustituciones en posición O-2 utilizando cultivos de dos BAL: Pediococcus parvulus 2.6, aislada de sidra, y la bacteria recombinante Lactococcus lactis NZ9000[pNGTF], que expresa la proteína GTF de la estirpe 2.6. Los EPSs han sido recuperados y purificados a partir de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos mediante precipitación con etanol, fraccionamiento cromatográfico y diálisis. Los métodos utilizados han permitido obtener preparaciones de ambos polímeros sin contaminación detectable de RNA, DNA o proteínas, siendo aptos para estudios inmunológicos. Los polisacáridos purificados han sido utilizados para caracterizar su potencial inmunomodulador y sus propiedades anti-inflamatorias en distintos modelos in vitro y ex vivo de inflamación intestinal humana. I. En modelos in vitro se ha evaluado el efecto de los EPSs sobre macrófagos pro-inflamatorios humanos: diferenciados a partir de monocitos (M1) y a partir de la línea celular monocitaria THP-1 (PMA-THP-1). No se detectó citotoxicidad y se ha comprobado un efecto inmunomodulador sobre ambos tipos de macrófagos. En condiciones de co-tratamiento con el LPS inflamatorio de Escherichia coli, ambos EPSs produjeron un incremento de los niveles de secreción de las citoquinas TNF-α, IL-12 p40 e IL-10, así como un aumento de la proporción anti-inflamatoria IL-10/TNF-α. Además, los EPSs alteraron el patrón de fosforilación de diversas quinasas en los macrófagos M1, activando las vías de señalización PI3K/mTOR/AKT, ErbB y de uniones adherentes. En modelo in vitro de mucosa intestinal humana inflamada en formato “transwell“, constituido por las líneas de células humanas Caco-2 (enterocitos) y PMA-THP-1 (macrófagos), los EPSs no mostraron toxicidad sobre las células Caco-2. Además, los polímeros provocaron cambios en los perfiles de expresión de citoquinas secretadas, a nivel proteico (TNF-α, IL-10 e IL-8) y transcripcional (TSLP, IL-8 e IL-10), demostrando el establecimiento de comunicación entre ambas líneas. En modelo ex vivo con biopsias de tejido de pacientes con enfermedad de Crohn, los tratamientos con los EPSs también tuvieron un efecto potencialmente anti-inflamatorio, y alteraron la transcripción de diferentes mediadores regulados por el factor de transcripción NFkB. En conjunto, los resultados obtenidos con los distintos modelos de intestino humano han demostrado que los tratamientos con los (1-3)-β-D-glucanos con sustituciones en O-2 producen una estimulación del sistema inmune, regulando la expresión de citoquinas y vías de señalización que afectan procesos de migración, proliferación y supervivencia celular, y se han observado diferencias entre los efectos producidos por cada uno de los dos EPSs estudiados.

Finalmente, los polisacáridos purificados también han sido utilizados para investigar su potencial como agentes antivirales e inmunomoduladores en modelos in vitro de II salmónidos. En modelo in vitro de infección de fibroblastos BF-2 de Lepomis macrochirus con el virus de la necrosis pancreática infectiva, los β-D-glucanos mostraron ausencia de toxicidad, inhibición de los efectos citopáticos y reducción del título vírico. En modelo in vitro de macrófagos primarios de truchas arcoíris, los EPSs provocaron una inducción de la expresión de los genes que codifican los interferones IFN-I e IFN-γ, mostrando así una estimulación de las respuestas inmunes innata y adaptativa. Con todo, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis Doctoral muestran un potencial de los (1-3)-β-D-glucanos con sustituciones en posición O-2 como agentes inmunomoduladores y anti-inflamatorios, de utilidad para la elaboración de alimentos funcionales o también en medicina humana o veterinaria.