Characterization and regulation of Kv1.5-Kvβ1.3 complex

Abstract

[EN]: Voltage dependent potassium channels (Kv) are membrane proteins involved in several physiological and pathological events. In fact, the normal electrophysiological behavior of the heart is determined by the ordered propagation of action potentials generated in the individual myocytes. Therefore, abnormalities of the generation, propagation, duration or configuration of individual cardiac action potentials (AP) are the basis of cardiac arrhythmias. K+ currents control the repolarization process of the cardiac AP, membrane potential, heart rate, myocardium refractoriness and, thus, they represent important molecular targets for the actions of neurotransmitters, hormones, drugs and toxins known to modulate cardiac function. Activation of Kv1.5 channels generates the ultrarapid outward potassium current (IKur) and because these channels are mostly expressed in atrial tissue, this current determines the atrial AP duration, representing a pharmacological target for the development of antiarrhythmic drugs useful in the treatment of supraventricular arrhythmias. Kv1.5 channels assembly with several Kvβ subunits (Kvβ1.2, Kvβ1.3 and Kvβ2.1). In particular, Kvβ1.3 subunits modify the electrophysiological characteristics of Kv1.5 channels, inducing a fast and partial inactivation, a greater degree of slow inactivation, a shift of the activation curve towards more negative potentials, and a decrease in the sensitivity of the channel to drug-induced blockade. Previous studies have shown that inhibition of PKC with calphostin C results in a small currents without the Kvβ1.3-induced fast inactivation. In the present Doctoral Thesis the mechanisms underlying this phenomenon, using electrophysiological and imaging techniques, were investigated in both heterologous (HEK293 cells) and native systems (rat and human cardiac tissue). The results obtained revealed the existence of a functional Kv1.5 channelosome, tightly regulated by PLC and PIP2, and conformed by, at least, Kvβ1.3, the receptor for activated C kinase (RACK1), PKCβI, PKCβII, and PKCθ in HEK293 cells. In this channelosome, Kvβ1.3 subunits seem to have a ‘linker’ role between Kv1.5 and RACK1 and, therefore, with the others components. Interestingly, a very similar Kv1.5 channelosome was found in rat ventricular but not in atrial tissue. PKC inhibition calphostin C-mediated also modifies the voltage dependent inactivation of Kv1.5-Kvβ1.3 channels and in their pharmacology that appear to be similar to that displayed by Kv1.5 channels alone. Indeed, the IC50 values for bupivacaine and for quinidine were similar to those reported for Kv1.5 block. Since PKC inhibition results in a reduction of the current magnitude, the recycling of Kv1.5-Kvβ1.3 channels was studied. We observed that PKC inhibition promotes a reduction of Kv1.5 density at the cell membrane and an increase in the channel internalized without modifying the total amount of the channel. Experiments in which Rab11 constitutively active was transfected, demonstrated that PKC activity was involved in the slow recycling of Kv1.5-Kvβ1.3 channels Rab11-meadiated. Finally, the functional role of the Lgi1 protein was analyzed. Lgi1 interferes with the fast inactivation Kvβ1-induced of Kv1 channels and mutations in this protein have been linked to certain types of epilepsy. After demonstrate its expression in rat cardiac tissue, with a similar expression pattern to Kvβ1.3, we have shown that Lgi1 prevents the Kvβ1.3-induced fast inactivation, either when Lgi1 was transfected or when the Lgi1 protein was added to the internal solution of the patch pipette with a decrease in the surface channel amount and cytoskeleton disorders. In addition, we show that the pattern of expression of Lgi1 is very similar to that shown by Kv1.5 in the human ventricle, leading us to propose Lgi1 as an important Kv1.5-Kvβ1.3 modulator.

[ES]: Los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) son proteínas de membrana involucradas en diversos procesos fisiológicos y fisiopatológicos. De hecho, el funcionamiento electrofisiológico normal del corazón está determinado por la propagación ordenada de potenciales de acción (PA) generados en miocitos individuales. Por lo tanto, anomalías en la génesis, propagación, duración o configuración de estos PA constituyen la causa de arritmias cardíacas. Las corrientes de K+ determinan la repolarización del PA cardíaco, el potencial de membrana, el ritmo cardíaco, la refractariedad del tejido cardíaco y, por tanto, constituyen importantes dianas moleculares para la acción de diversos moduladores de la función cardíaca. Los canales Kv1.5 son los principales responsables de la génesis de la corriente de salida ultrarápida de potasio (IKur) y, debido a que se expresan mayoritariamente en aurícula, la IKur determina la duración del PA auricular. Así, estos canales representan una diana farmacológica para el desarrollo de fármacos útiles en el tratamiento de arritmias supraventriculares. Estos canales se ensamblan con diversas subunidades Kvβ. En particular, las subunidades Kvβ1.3 modifican las características electrofisiológicas de los canales Kv1.5, induciendo una inactivación rápida y parcial, un mayor grado de inactivación lenta, un desplazamiento de la curva de activación hacia potenciales más electronegativos, y una disminución en la sensibilidad del canal al bloqueo inducido por fármacos. Tras inhibir la PKC con calfostina C los canales Kv1.5-Kvβ1.3 generan corrientes de pequeña magnitud y sin inactivación rápida inducida por la Kvβ1.3. En esta Tesis Doctoral hemos investigado los mecanismos subyacentes a este fenómeno utilizando técnicas electrofisiológicas y de imagen en sistemas heterólogos (células HEK293) y en tejidos nativos (miocardio de rata y humano). Los resultados obtenidos demuestran la existencia de un canalosoma funcional de Kv1.5, estrechamente regulado por PLC y PIP2, y constituido por, al menos, Kvβ1.3, el receptor de quinasas C activadas (RACK1), PKCβI, PKCβII, y PKCθ en células HEK293. En este canalosoma, las subunidades Kvβ1.3 parecen tener un papel ‘conector’ entre Kv1.5 y RACK1 y, por tanto, con el resto de componentes del mismo. Un canalosoma Kv1.5 muy similar se encontró en ventrículo de rata pero no en aurícula. La inhibición de PKC inducida por calfostina C también modifica la inactivación dependiente de voltaje de los canales Kv1.5-Kvβ1.3, así como sobre su farmacología que resulta ser más similar a la de Kv1.5. De hecho, los valores de IC50 para bupivacaína y quinidina fueron similares a los obtenidos para el bloqueo de Kv1.5. Dado que la inhibición de la PKC disminuye la magnitud de las corrientes generadas por los canales Kv1.5-Kvβ1.3, estudiamos el reciclaje de los canales Kv1.5-Kvβ1.3. Observamos que la inhibición de la PKC promueve una reducción de la densidad de canales Kv1.5 en membrana y un aumento de los canales internalizados sin modificar la cantidad total de los mismos. Experimentos en los que

transfectamos Rab11 constitutivamente activo demostraron que PKC está involucrada en el reciclaje lento de los canales Kv1.5-Kvβ1.3 mediado por Rab11. Por último, analizamos el papel funcional de la proteína Lgi1, que interfiere con la inactivación rápida inducida por Kvβ1 sobre los canales Kv1 y que ha sido relacionada con ciertos tipos de epilepsia. Tras demostrar su expresión en el tejido cardíaco de rata, con un patrón de expresión similar a Kvβ1.3, demostramos que Lgi1 anula la inactivación rápida inducida por Kvβ1.3, tanto tras transfectar Lgi1, como tras añadirla a la solución interna de la pipeta; lo que se acompañaba de una disminución en la cantidad de canal en la membrana celular y de modificaciones del citoesqueleto. Además, demostramos que el patrón de expresión de Lgi1 es muy similar al de Kv1.5 en el ventrículo humano, lo que nos lleva a proponer a Lgi1 como un nuevo e importante modulador del complejo Kv1.5-Kvβ1.3.