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Título

Kv modulation by polyunsaturated fatty acids. Functional study of a new Kv7.1 mutation associated to short QT syndrome

AutorMoreno, Cristina
DirectorValenzuela, Carmen ; González, Teresa
Fecha de publicación2013
EditorCSIC-UAM - Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (IIBM)
Universidad Autónoma de Madrid
Resumen[EN]: Voltage dependent potassium channels (Kv) are membrane proteins highly modulated by several physiological, pharmacological and pathological events. Also, Kv channels are involved in a plethora of pathophysiological process, including immune response and cardiac arrhythmias. Ion channels and in particular, potassium channels play a pivotal role in the modulation of macrophage physiology. It has been described that an increased consumption of PUFAs in the diet possesses anti-inflammatory actions. In fact n-6 and n-3 derived lipid mediators, such as the lipoxins and resolvins (whose production is increase in the presence of aspirin) have emerged as novel potent agents that counter-regulate excessive acute inflammation and stimulate molecular and cellular events that define resolution. In the present Doctoral Thesis, the modulation of Kv and Kir channels by lipoxins was analyzed. Currents were recorded in bone marrow derived macrophages (BMDM) using the patchclamp technique. Acute treatment of LPS-stimulated BMDM with e-LXA4 resulted in a decrease of Kv currents, compatible with attenuation of the inflammatory response. More importantly, long-term treatment of LPSstimulated BMDM with e-LXA4 significantly reverted LPS effects on Kv and Kir currents, intracellular calcium levels, diminished NF-κB and IKKβ activity, and protected against LPS activation-dependent apoptosis. These effects were mediated, at least in part, via the lipoxin receptor (ALX). We provide evidence for a new mechanism by which e-LXA4 contributes to inflammation resolution consisting in the revertion of LPS effects on Kv and Kir currents in macrophages. In addition, it has been report that PUFAs can modify the electrical activity of the heart due to their ability to modulate cardiac ion channels. In the present Doctoral Thesis, we analyzed the effects of acute and chronic application of EPA and DHA on the current and the expression of Kv7.1/KCNE1 channels transiently expressed in COS7 cells by using patch-clamp, Western blot, and lipid rafts extraction techniques. Depending on the way of administration, PUFAs differentially modified this current. Acute perfusion with EPA increased Kv7.1/KCNE1 current magnitude, slowed the activation kinetic and induced a leftward shift of the activation curve. On the contrary, chronic EPA did not modified Kv7.1/KCNE1 current and shifted the activation curve towards the opposite direction. In addition, chronic EPA decreased the expression of Kv7.1 but not of KCNE1, and induced a wider distribution of Kv7.1 over the cell membrane. Experiments with methyl-β-cyclodextrin demonstrated that removal of cholesterol increased the Kv7.1 current magnitude. In cholesterol depleted cells, EPA produces similar effects than those produced acutely that could be reverted after wash-out with drug-free external solution, suggesting a direct effect on the channel. Mutations involving cardiac ion channels result in abnormal action potential (AP) formation or propagation, leading to cardiac arrhythmias. They constitute approximately 10–20% of all sudden cardiac death (SCD). The short QT syndrome is a new congenital entity characterized by a shortened QTc interval in the ECG and a lack of adaptation during increasing heart rates. In the present Doctoral Thesis,
we used the patch-clamp technique to characterize the novel F279I Kv7.1 mutation found on a 23 years old man with a QTc of 356 ms and a familial history of SCD. In the absence of KCNE1, WT and F279I Kv7.1 currents had similar biophysical properties. However, functional analysis of F279I Kv7.1 (alone or co-expressed with the WT channel, in the presence of KCNE1) revealed a pronounced shift of the half-activation potential and an acceleration of the activation kinetics leading to a gain of function in IKs. We conclude that the F279I mutation would predict to augment substantially repolarizing current during the AP due to an impaired coupling of the Kv7.1 gating modulation induced by KCNE1.
[ES]: Los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) son proteínas de membrana que se encuentran altamente moduladas en diversos procesos fisiológicos, y patológicos tales como la respuesta inmune y la función cardiaca. Los canales iónicos, y en particular los canales de potasio, juegan un papel esencial en la fisiología de los macrófagos. Se ha descrito que un incremento en la dieta de ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs) posee propiedades antiinflamatorias. Es más, mediadores lipídicos derivados de AGPIs n-6 y n-3, como lipoxinas y resolvinas (cuya producción aumenta tras la ingesta de aspirina), han surgido como nuevos y potentes agentes que regulan la inflamación aguda promoviendo la resolución. En la presente Tesis Doctoral se estudió la modulación por lipoxinas de los canales Kv y Kir presentes en macrófagos derivados de médula ósea (MDMO) mediante la técnica de patch-clamp. El tratamiento agudo con e-LXA4 de MDMO estimulados con LPS disminuyó la corriente Kv, lo que es compatible con la atenuación de la respuesta inflamatoria. De manera más relevante, el pretratamiento con e-LXA4 de MDMO estimulados con LPS revertió los efectos producidos en las corrientes Kv y Kir, en los niveles de Ca2+ intracelular, disminuyó la actividad de NF-κB e IKKβ y protegió contra la apoptosis inducida por LPS. Estos efectos fueron mediados, al menos en parte, a través de la vía dependiente del receptor de lipoxinas (ALX). Este trabajo describe un nuevo mecanismo por el cual la e-LXA4 contribuye a la resolución de la inflamación que consiste en la prevención de los efectos del LPS sobre las corrientes Kv y Kir de MDMO. Además, se ha descrito que los AGPIs modifican la actividad eléctrica del corazón a través de la modulación de canales iónicos. En la presente Tesis Doctoral, se analizaron los efectos de la aplicación aguda y crónica de EPA y DHA en la corriente generada por Kv7.1/KCNE1 expresados transitoriamente en células COS7 mediante la técnica de patch-clamp, western blot y aislamiento de balsas lipídicas. En función del modo de administración, los AGPIs modificaron dicha corriente de manera diferencial. La perfusión aguda con EPA aumentó la magnitud de Kv7.1/KCNE1, enlenteció la cinética de activación y desplazó la curva de activación (CA) hacia la izquierda. Por el contrario, el EPA crónico no modificó la corriente Kv7.1/KCNE1 pero desplazó la CA en dirección opuesta. Además, EPA crónico disminuyó la expresión de Kv7.1 pero no de KCNE1, e indujo una redistribución de Kv7.1 en la membrana celular. Experimentos con metil-β-ciclodextrina mostraron que la depleción de colesterol aumenta la magnitud de Kv7.1/KCNE1. En estas células, EPA ejerció efectos similares a los producidos tras su administración aguda, efectos que fueron revertidos tras el posterior lavado con solución libre de AGPI, sugiriendo una interacción directa con el canal. Por otro lado, mutaciones en canales iónicos cardiacos alteran la formación y propagación normal de los potenciales de acción, lo que puede generar la aparición de arritmias. El síndrome de QT corto es una nueva entidad
clínica que se caracterizada por un acortamiento del intervalo QTc en el ECG y por una falta de adaptación durante el ejercicio. En la presente Tesis Doctoral, se caracterizó mediante la técnica de patch-clamp la nueva mutación F279I Kv7.1 encontrada en un varón de 23 años con un QTc de 356 ms con una historia clínica familiar de MSC. En ausencia de KCNE1, la corriente silvestre y F279I Kv7.1 exhibieron propiedades biofísicas similares. Sin embargo, el canal F279I Kv7.1 expresado en homo o heterozigosis con el canal silvestre y en presencia de KCNE1 mostró un pronunciado desplazamiento de la CA y una aceleración de la cinética de activación, permitiendo una ganancia de función en IKs. Se concluye, por tanto, que la mutación F279I provoca un aumento sustancial en la corriente de repolarización durante el PA debido a una modulación defectuosa de KCNE1 del “gating” de Kv7.1.
DescripciónMemoria presentada en el Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid, para optar al grado de Doctor con Mención Internacional por Cristina Moreno Vadillo, Licenciada en Bioquímica y Biología y realizada en el Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols del CSIC.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/125580
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