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Title

Nuevos péptidos antibacterianos derivados de proteínas lácteas. Estudio del mecanismo de acción y efecto sinérgicos

AuthorsLópez-Expósito, Iván
AdvisorRecio, Isidra ; Amigo, Lourdes
Issue Date2006
PublisherCSIC - Instituto de Fermentaciones Industriales (IFI)
Universidad Autónoma de Madrid
AbstractEn la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la Identificación, el estudio de efectos en la membrana bacteriana y la evaluación del efecto sinérgico de nuevos péptidos con actividad antibacteriana derivados de proteínas lácteas. Esta Tesis se ha estructurado en cuatro partes. En el primer apartado se ha evaluado la formación de péptidos con actividad antibacteriana a partir de alfas2-caseína ovina y -caseína bovina tras la hidrólisis con enzimas digestivas. Una vez generados los hidrolizados se han aislado los péptidos medíante diferentes técnicas cromatográficas. La identificación y caracterización de dichos péptidos se ha llevado a cabo a través de espectrometría de masas en tándem. Los fragmentos más activos se sintetizaron químicamente con el fin de evaluar su actividad antibacteriana. De este modo, se identificaron 12 secuencias peptidicas antibacterianas no descritas anteriormente en la bibliografía. Adicionalmente se evaluó la actividad inhibidora de la ECA y actividad antioxidante en los hidrolizados generados. Los hidrolizados de alfa2-caseína ovina y kappa-caseína bovina con pepsina mostraron tener actividad inhibidora de la ECA y antioxidante. Por ello, se estudió la actividad inhibidora de la ECA y antioxidante a cada uno de los péptidos con actividad antibacteriana sintetizados, encontrando que el fragmento de la s2-caseína de secuencia PYVRYL poseía además de actividad antibacteriana, potente actividad inhibidora de la ECA, antihipertensiva y antioxidante. En la segunda parte se ha estudiado el mecanismo de acción del f(183-207) derivado de la alfas2-caseína bovina. Para ello se realizaron ensayos con el objetivo de identificar el sitio inicial de unión del péptido a la membrana bacteriana así como la posible existencia de daño en las membranas tanto interna como externa de las bacterias. Finalmente, se llevaron a cabo observaciones mediante microscopía electrónica de transmisión. Los efectos de este péptido sobre la membrana bacteriana se compararon con los producidos por la lactoferricina-B. Los resultados mostraron que los sitios iniciales de unión del péptido eran el ácido lipoteicoíco en el caso de las bacterias Gram-positivas y el lipolisacárido en las Gram-negativas. Los ensayos de permeabilización de la membrana externa e interna manifestaron que el f(183-207) era capaz de permeabilizar la membrana interna, y que la lactoferricina-B permeabilizaba tanto la membrana externa como la interna, algo que no había sido descrito previamente en la bibliografía. Las mícrofotografias de microscopía electrónica de transmisión mostraron que el f(183-207) era capaz de formar poros en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y en la pared bacteriana de las Gram-positivas. En las bacterias Gram-negativas el f(183-207) provocó la condensación del citoplasma y en las Gram-positivas la expulsión de parte del contenido citoplásmico al medio extracelular.
En la tercera parte se evaluó el efecto sinérgico entre las proteínas lácteas lactoferrina y lisozima, los péptidos f(183-207) de la alfas2-caseína bovina y la lactoferricina-B frente a microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos. Además se realizaron combinaciones con la nisina y los péptidos mencionados. Los resultados revelaron efecto sinérgico en las combinaciones formadas por lactoferrina y lactoferricina-B, lisozima y lactoferricina-B, lactoferrina con el f(183-207) de la alfas2-caseína bovina, lisozima con el f(183-207) y nisina con el f(183-207). Es importante destacar el efecto sinérgico identificado entre lactoferrina y lactoferricina-B, ya que ambas proteínas podrían coexistir en el tracto gastrointestinal del lactante. En la cuarta parte de esta Tesis Doctoral se determinó la actividad antibacteriana frente a microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos de leches humanas a lo largo del proceso de lactación antes y tras la simulación del proceso de digestión gastrointestinal. Se detectó lactoferrina parcialmente degradada tras la simulación de la digestión gastrointestinal. Tras la simulación de la digestión gastrointestinal a una muestra de leche humana y posterior medida de la actividad antibacteriana se observó que la actividad antibacteriana era ligeramente superior a la de la leche sin hidrolizar. Esto podría deberse a la formación de péptidos con actividad antibacteriana, como la lactoferricina, o fragmentos que contuviesen a la misma que podrían actuar de forma sínérgica con la lactoferrina.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/101616
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