TrwC, una relaxasa conjugativa con actividad de integrasa sitio-específica: Caracterización de la reacción y potencial biotecnológico

Abstract

TrwC es la relaxasa del plásmido conjugativo R388, responsable de la movilización del DNA durante la conjugación bacteriana. TrwC presenta actividad de endonucleasa sitio-específica y de transferasa de cadenas en su dominio N-terminal. Es una proteína con gran talento: a parte de su papel en conjugación, TrwC es una recombinasa sitio específica, capaz de actuar sobre dos repeticiones directas de su secuencia diana, el origen de transferencia (oriT), presente en un plásmido de doble cadena y en ausencia de conjugación. Más aún, TrwC promueve la integración de una molécula de DNA transferida conjugativamente en la molécula receptora que contenga un oriT diana. Hasta el momento, esta habilidad sólo ha sido descrita para TrwC y presenta gran potencial biotecnológico. Para conocer las bases moleculares, la reacción de integración sitio-específica ha sido analizada en bacterias. Para ello, hemos estudiado los requerimientos de DNA y proteína de la reacción. La reacción de integración es altamente específica, TrwC cataliza dicha reacción al reconocer su sustrato, el oriT. Uno de los grandes logros de este trabajo ha sido demostrar que TrwC puede catalizar integración sitio-específica empleando como diana un oriT mínimo de 17 pb. Además, la reacción también tiene lugar cuando empleamos dianas naturales encontradas en el genoma humano que se asemejan al oriT mínimo canónico. Este hecho es de gran relevancia ya que TrwC podría disponer de secuencias diana naturales en el genoma humano para catalizar la reacción de integración, lo cual convierte a TrwC en una valiosa herramienta con fines biotecnológicos. Así, el segundo objetivo de este trabajo ha sido el estudio del potencial de TrwC como herramienta de ingeniería genómica. Este estudio ha sido abordado en tres pasos: introducción del complejo TrwC-DNA en células humanas, su entrada al núcleo y la integración sitio-específica del DNA en dichas células. Para introducir los complejos TrwC-DNA en las células, por un lado, hemos manipulado los sistemas de secreción tipo IV (T4SS) de bacterias patógenas para enviar dichos complejos a células humanas específicas, y por otro, hemos utilizado la tecnología de los virus recombinantes basados en el virus adeno-asociado (AAV). La localización de TrwC en las células humanas es citoplasmática. Por PCR mutagénica, hemos conseguido un mutante de TrwC que se dirige al núcleo y es funcional en conjugación y en recombinación. Por último, hemos establecido un ensayo episomal para detectar integración sitio-específica en células humanas, empleando la tecnología de los virus AAV recombinantes para introducir TrwC y el DNA en las células humanas apropiadas, que contienen episomas con la diana de TrwC. En este trabajo proponemos una nueva aplicación biotecnológica de los sistemas conjugativos, un sistema de ingeniería genómica basado en el sistema conjugativo del plásmido R388. Manipulando los T4SS y la proteína piloto TrwC, junto con su habilidad única para integrar sitio-específicamente, podríamos establecer un nuevo sistema de modificación genómica que contribuiría con ventajas en un gran número de aplicaciones en biotecnología y biomedicina.