Estudio comparativo de sistemas de secreción tipo IV implicados en transferencia conjugativa de DNA y virulencia bacteriana

Abstract

[ES]: Los sistemas de secreción tipo IV (T4SS) son una gran familia de sistemas de secreción que se encuentra ampliamente distribuidos entre las bacterias, y que presentan roles biológicos muy diferentes a pesar de la gran homología que que comparten entre sí, siendo imprescindibles para la conjugación o para la virulencia de aquellas cepas que los codifican. En ete trabajo, el estudio de dos T4SS implicados en transferencia de DNA y virulencia, nos ha permitido manipular sus componentes, consiguiendo movilizar DNA desde Bartonella hacia células humanas. Esto podría sentar las bases para una herramienta de transferencia e integración sitio-específica en el genoma humano de DNA de cualquier origen y longitud. Esta sería una herramienta de gran valor en el campo de la terapia génica. Para ello, primero realizamos un estudio comparativo de los T4SS Trw de R388 y Bartonella, estableciendo los componentes que pueden ser intercambiados, estructural y funcionalmente. Además, hemos desarrollado un análisis mutacional de la proteína acopladora de R388 (TrwB). Hemos creado mutantes que interaccionan más fuertemente con el T4SS y analizado el efecto de estas mutaciones junto con otras presentes en otras regiones de la proteína con distintas funciones. Para ver el efecto de las mutaciones en la funcionalidad de TrwB, además hemos desarrollado un sistema donde las condiciones limitantes de TrwB descubren los efectos de estas mutaciones, ya que en el sistema stándar, la elevada cantidad de TrwB a menudo impide ver los efectos de dichas mutaciones. Por último, hemos conseguido movilizar DNA de Bartonella a células humanas, estudiando las implicaciones en este procesos de los distintos T4SS presentes en la bacteria.

[EN]: The conjugative coupling protein TrwB is responsible for connecting the relaxosome to the type IV secretion system during conjugative DNA transfer of plasmid R388. It is directly involved in transport of the relaxase TrwC, and it displays an ATPase activity probably involved in DNA pumping. We designed a conjugation assay in which the frequency of DNA transfer is directly proportional to the amount of TrwB. A collection of point mutants was constructed in TrwB cytoplasmic domain on the basis of the crystal structure of TrwBΔN70, targeting the NTP-binding region, the cytoplasmic surface, or the internal channel in the hexamer. An additional set of transfer-deficient mutants was obtained by random mutagenesis. Most mutants were impaired in both DNA and protein transport. We found that the integrity of the nucleotide binding domain is absolutely required for TrwB function, being also involved in monomer-monomer interactions. Polar residues surrounding the entrance and inside the internal channel are important for TrwB function, and may be involved in interactions with the relaxosomal components. Finally, the N-terminal transmembrane domain of TrwB was subjected to random mutagenesis followed by a two-hybrid screen for mutants showing enhanced protein-protein interactions with the related TrwE protein of Bartonella tribocorum. Several point mutants were obtained in the transmembranal helices; specifically, one Proline from each protein may be the key residue involved in the interaction of the coupling protein with the type IV secretion apparatus.