Quantifying RNA and DNA in planktonic organisms with SYBR Green II and nucleases. Part A. Optimisation of the assay

Abstract

[EN] Assay protocols for RNA and DNA in crude plankton extracts using the fluorochrome SYBR Green II are developed here. The method is based on the fluorescence in 3 aliquots: the first measures RNA after DNA digestion; the second measures DNA after RNA digestion; and the third measures residual fluorescence after digestion of both DNA and RNA. This residual fluorescence measurement is critical for accurate calculations of the nucleic acids. Optimisation of the assay conditions are described: fluorochrome concentration, buffer composition, fluorescence stability, temperature and duration of nuclease incubation. In the optimised procedure, the assays are performed in 5 mM Tris buffer (containing 0.9 mM CaCl2·2H2O and 0.9 mM MgCl2·6H2O, pH 8.0); DNase and RNase incubations are conducted at 37ºC for 20 min; the fluorochrome is added to all assays at a final concentration of 3.5x10-4 and readings are done within the 10-60 min period following the SYBR Green II addition. The study evidenced the importance of the residual fluorescence after nuclease digestion, which is especially taken into account in the calculation of the nucleic acid concentrations. Finally, the variability of the fluorescent response to different RNA and DNA standards is examined; from the performed tests, calculations are based on rRNA from calf liver and DNA from calf thymus standards. The accompanying paper (Berdalet et al., 2005) describes the development of the extraction protocol, as well as the application of both protocols in measuring RNA/DNA ratios in natural plankton samples, and a comparison with ethidium bromide based methods

[ES] En este trabajo se desarrollan los protocolos para la cuantificación de ARN y ADN en extractos no purificados de plancton utilizando SYBR Green II. El método se basa en la fluorescencia de 3 alícuotas: la primera mide el ARN tras la digestión del ADN; la segunda mide el ADN tras la digestión del ARN y la tercera mide la fluorescencia residual tras la digestión tanto del ARN como del ADN. La medida de esta fluorescencia residual es crítica para obtener una buena estimación de los ácidos nucleicos. Se describen las condiciones de optimización del ensayo: concentración de fluorocromo, composición del tampón, estabilidad de la fluorescencia, temperatura y duración de la incubación con nucleasas. En el procedimiento optimizado los ensayos se realizan en tampón Tris 5 mM (0.9 mM CaCl2·2H2O y 0.9 mM MgCl2·6H2O, pH 8); las incubaciones con nucleasas se llevan a cabo a 37°C durante 20 min; el fluorocromo se añade a todos los ensayos a una concentración final de 3.5X10-4 y las lecturas se realizan en los 10-60 min posteriores a la adición de SYBR Green II. Este estudio evidencia la importancia de la fluorescencia residual después de la digestión con nucleasas, la cual es especialmente incluída en el cálculo de las concentraciones de ácidos nucleicos. Finalmente, se examinó la variabilidad de la respuesta fluorescente a diferentes patrones de ARN y ADN (rARN de hígado de ternera y ADN de bazo de ternera). La segunda parte de este estudio describe el desarrollo del protocolo de extracción, así como la aplicación de ambos protocolos para medir los cocientes ARN/ADN en muestras de plancton naturales y una comparación con los métodos basados en bromuro de etidio