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dc.contributor.advisorJiménez-Barbero, Jesús-
dc.contributor.authorCanales, Ángeles-
dc.date.issued2005-03-17-
dc.identifier.uri10261/42246-
dc.descriptionTesis leida en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias el 17/03/2005. 195 pp.es_ES
dc.description.abstract1.- Se ha sintetizado y purificado el factor de crecimiento de fibroblastos ácido, FGF1, en abundancia natural, para después obtenerlo etiquetado con 15N y, por último, doblemente etiquetado con 15N y 13C, con el fin de facilitar el estudio estructural por RMN. El mejor rendimiento obtenido fue de 28 mg por 250 ml de cultivo (112 mg por litro). 2.- Se ha conseguido la asignación de las señales de RMN del complejo formado por el FGF1 y un hexasacárido análogo de heparina, sobre la base de experimentos 2D-HSQC, 2D NOESY, 2D TOCSY, 3D-HNCA, 3D-HN(CO)CA, 3D TOCSY-HSQC, y 3D NOESY-HSQC. 3.- Los parámetros de RMN obtenidos se han analizado para determinar, en primer lugar, los elementos de estructura secundaria de la proteína en el complejo. La proteína asociada contiene 12 láminas beta, de acuerdo con lo descrito para otros FGFs. 4.- A partir de los datos de RMN, mediante la combinación de los experimentos 3DNOESY- HSQC y 2D-NOESY, se obtuvieron 1587 restricciones de distancia, de las que 1407 fueron significativas conformacionalmente: 261 intrarresiduo, 472 secuenciales, 185 a media distancia (1<i-j<5) y 489 a larga distancia (i-j ≥5). 5.- Estas restricciones se emplearon en un protocolo de cálculo utilizando el programa DYANA (DYnamics Algorithm for NMR Applications), seguido de un proceso de simulación de dinámica molecular restringida con AMBER 5.0, para obtener la estructura tridimensional de la proteína en el complejo. El valor de la desviación cuadrática media (RMSD) de las posiciones atómicas para la superposición de las cadenas principales de las 20 mejores estructuras refinadas (entre los residuos 26-150) es de 1,14 Å. Los residuos que aparecen poco definidos están situados en los giros 1, 3, 4 y 6, y en los bucles 3 y 4. El RMSD obtenido para las mismas 20 estructuras, excluyendo estas zonas de menor definición es de 0,99 Å.es_ES
dc.description.abstract6.- Se ha determinado la conformación del hexasacárido en su complejo con el FGF1, mediante el empleo de experimentos bidimensionales TOCSY y NOESY doblemente filtrados en 13C (secuencias X-double-half-filter). Estos fueron adquiridos para una muestra del complejo en el que la proteína está marcada con los isótopos 15N y 13C y el carbohidrato está en abundancia natural. La conformación alrededor de los enlaces glicosídicos no varía sensiblemente respecto de la existente para el oligosacárido libre y es una hélice a derechas. 7.- Los anillos de ácido idurónico presentan un equilibrio bote-silla en el complejo. Este comportamiento dinámico en la forma asociada es novedoso. El FGF1 no selecciona una única conformación del azúcar, en contra con lo descrito para otras proteínas que reconocen fragmentos de heparina, como, por ejemplo, la antitrombina-III. Este comportamiento dinámico local puede ser posible debido a que las interacciones principales entre ligando y receptor involucran grupos sulfato del azúcar y cadenas laterales de lisinas y argininas de la proteína, que muestran una elevada flexibilidad. Posiblemente, el reconocimiento de varias conformaciones del hexasacárido sea un modo que utiliza esta proteína para minimizar el coste entrópico del proceso de reconocimiento molecular. 8.- El sitio de unión de la proteína al hexasacárido se ha determinado, en primer lugar, sobre la base de las diferencias de desplazamiento químico de las señales N-H de la proteína libre y asociada al hexasacárido. Los aminoácidos con mayores variaciones de δ en el complejo son: N32, H55, L87, H116, G124, G129, K132, G134, R136, H138, Y139 e I144. Asimismo, se han determinado una serie de NOEs intermoleculares entre el azúcar y las cadenas laterales de los aminoácidos K127, S130, R133 y K142 del FGF1, que han permitido localizar el sitio de unión entre los residuos 126 al 144. Estos NOEs intermoleculares, unidos a los resultados obtenidos mediante un protocolo de modelización molecular con AUTODOCK 3.0, han permitido obtener un modelo tridimensional de la estructura del complejo.es_ES
dc.description.abstract9.- Se han determinado las características dinámicas del FGF1 en su estado libre y en el complejo con el hexasacárido, mediante la medida de parámetros de relajación de 15N-RMN, registrados a 500 y 750 MHz. Los parámetros medidos han sido R1, R2 y el NOE heteronuclear 1H-15N. Los datos de relajación indican inequívocamente que la proteína no dimeriza al asociarse y que su movimiento global, tanto en el estado libre, como en el asociado, es prácticamente isotrópico. 10.- La proteína presenta un grado apreciable de flexibilidad en el estado libre, en el que más de 25 aminoácidos presentan fenómenos de intercambio químico. Sin embargo, se rigidifica de modo importante en presencia del oligosacárido, ya que sólo cuatro aminoácidos muestran intercambio químico y el parámetro de orden promedio, una medida del grado de restricción al movimiento, aumenta sensiblemente respecto al estado libre. 11.- Algunos residuos siguen presentando flexibilidad diferencial y pueden relacionarse con el sitio de unión al receptor. Así, se ha descrito que la Arg 49, la Leu 149, y la Tyr 108 son puntos de interacción con el receptor del FGF (FGFR). Por ello, la flexibilidad que manifiestan estos aminoácidos cuando el FGF se asocia a este GAG puede ser responsable de la capacidad del FGF1 para interaccionar con los FGFRs. 12.- Adicionalmente, a partir de las variaciones de los valores del parámetro de orden S2 entre los estados libre y asociado, es posible hacer una estimación de la contribución de la entropía conformacional al proceso de asociación. Se obtiene que la formación del complejo 1-FGF1 tiene una penalización entrópica de -TΔS ≈ 22 kcal/mol a 298 K.es_ES
dc.description.sponsorshipEl presente trabajo se ha llevado a cabo en el Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC con ayuda de una beca FPI del Ministerio de Ciencia y Tecnología, asociada al proyecto de investigación BQU2000-1501-C02-01es_ES
dc.language.isospaes_ES
dc.publisherCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)es_ES
dc.publisherUniversidad Autónoma de Madrides_ES
dc.rightsopenAccesses_ES
dc.subjectReconocimiento molecular/Molecular recognitiones_ES
dc.subjectRMN/NMR (Resonancia Magnética Nuclear/Nuclear Magnetic Resonancees_ES
dc.subjectQuímica de Carbohidratos/Carbohydrate Chemistryes_ES
dc.subjectGlicobiología/Glicobiologyes_ES
dc.titleEstudios sobre el complejo monomérico, con actividad mitogénica, formado por el factor de crecimiento para fibroblastos ácido (FGF1) y un hexasacárido de diseño, análogo de heparina. Una visión estructural y dinámica utilizando RMN.es_ES
dc.typetesis doctorales_ES
dc.description.peerreviewedPeer reviewedes_ES
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