Expressió simultània de gens de defensa per a la producció de varietats d’arròs resistents a patògens i insectes plaga

Abstract

[EN] This work is part of integrated project focused on the improvement of resistance against pests and phytopathogens in rice. The general goal has been the simultaneous expression of genes encoding insecticides and antifungal proteins in transgenic rice plants. As a first approach, the effectiveness of the expression of a fusion gene that encodes two protease inhibitors, genes mpi (maize proteinase inhibitor) and pci (potato carboxypeptidase inhibitor) has been evaluated. The proteinase inhibitors are part of the natural defence system of plants against insect predation. For the simultaneous expression of these two genes has been used several strategies, including (1) the use of a viral sequence called “2A”, a self-cleaving oligopeptide, (2) through a sequence of processing the protoxina Cry1B processed by insect enzymes (defined as a sequence 'C') or (3) by crossing pci and mpi lines of rice. Secondly, a regulator gene of the defence response in Arabidopsis (gene AtNPR1; Non Expressor of Pathogenesis Related gene 1) has been used as transgen for the simultaneous expression of endogenous defence genes in rice plant.

The gene fusion mpi-pci is expressed correctly under the control of the mpi wound-inducible promoter and terminator regions. Using the processing sequence 2A, the protein product (MPI-2A-PCI) is partially processed in transformed rice cell, whereas MPI-C-PCI accumulates as a non-processed polyprotein. Expression of mpi-pci gene using both strategies (2A fragment and sequence C) confers resistance against the striped stem borer (Chilo suppressalis) larvae in transgenic rice plants. Bioassays performed with transgenic rice plants expressing the mpi-pci gene and infested with Chilo larvae showed a significant reduction of the larval weight compared with the control larvae group.

Although the role of plant protease inhibitors has been described exclusively in the defense against insect attack, we reported about the potential role of the PCI inhibitor involved in resistance to fungal pathogens. Rice plants expressing constitutively the pci gene exhibit resistance against the economically important pathogens Magnaporthe oryzae and Fusarium verticillioides. By affinity chromatography a carboxypeptidase of M. oryzae was purified using the PCI protein, and subsequently characterized by mass spectrometry. This fungal protein came out to be a novel carboxypeptidase B (MoCPB) which was fully inhibited by PCI. Homology-based modelling revealed structural similarities between the predicted structure of the MoCPB and the crystal structure of insect carboxypeptidases. Overall, these results indicate that PCI exerts its antifungal activity through the inhibition of this particular fungal carboxypeptidase.

In the second part of this work we demonstrated that constitutive expression of the Arabidopsis AtNPR1 gene in rice confers resistance against the fungal pathogens M. oryzae and F. verticillioides, and the bacterial pathogen Erwinia chrysantemi. The protection of AtNPR1 against M. oryzae is due to the priming expression of salicylic acid-responsive endogenous genes (PR1b, PR5, HR-6, PR10 and PBZ). Transgenic AtNPR1 rice plants grown in the greenhouse showed growth retardation, reduced height and smaller seeds than wild type plants. When transferred to plant growth chambers, AtNPR1 plants developed spontaneous lesions (lesion mimic phenotype) showing typical cellular markers of lesion formation, such as accumulation of superoxide ions and autofluorescent material in the cell walls. On the other hand, AtNPR1-expressing rice plants showed a higher susceptibility to infection by the Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). Moreover, AtNPR1 negatively regulates the expression of genes playing a role in the plant response to salt and drought stress, namely the rab21, salT and dip1 genes, resulting in a higher sensitivity to both types of abiotic stress. These observations suggest that AtNPR1 has both positive and negative regulatory roles in mediating defence responses against biotic and abiotic stresses.

[CAT] Aquest treball s’emmarca dins d’una de les principals línees d’investigació del nostre grup, dirigida a l’avaluació d’estratègies aplicables a l’obtenció de varietats d’arròs resistents a patògens i insectes plaga mitjançant transformació genètica. L’objectiu general ha estat l’expressió simultània de gens vegetals que codifiquen proteïnes insecticides i antifúngiques en plantes d’arròs transgèniques. En primer lloc s’ha avaluat l’eficàcia de l’expressió d’un gen fusió que codifica dos inhibidors de proteases, els gens mpi de blat de moro (maize proteinase inhibitor) i pci de patata (potato carboxypeptidase inhibitor). Per a l’expressió simultània d’aquets dos gens s’han utilitzat vàries estratègies, com són, 1) l’ús d’una seqüència viral anomenada “2A” capaç de patir autoprocessament, 2) mitjançant una seqüència de processament de la protoxina Cry1B (definida com a seqüència “C”) processada per enzims d’insectes o 3) mitjançant creuament de línees d’arròs pci i mpi. En segon lloc, s’ha estudiat l’ús d’un gen regulador de la resposta de defensa a Arabidopsis, el gen AtNPR1 (Non Expressor of Pathogenesis Related genes 1), com a transgen per l’expressió simultània de gens de defensa endògens de la planta d’arròs.

El gen fusió mpi-pci s’expressa correctament sota el seu propi promotor i terminador. Quan s’utilitza la seqüència 2A, el producte obtingut (proteïna MPI-2A-PCI) es processa parcialment a la cèl·lula d’arròs, mentre que la MPI-C-PCI s’acumula com a poliproteïna no processada. L’expressió del gen mpi-pci emprant ambdues estratègies (2A and C) confereix resistència front infestació amb larves del lepidòpter plaga (Chilo suppressalis). Bioassaigs amb plantes transgèniques d’arròs mpi-pci infestades mostren una reducció significativa del pes larval en comparació amb larves control.

Tot i que tradicionalment s’ha atribuït un paper insecticida als inhibidors de proteases vegetals, hem demostrat el potencial del PCI com a agent antifúngic. Així, plantes transgèniques que expressen constitutivament el gen pci mostren resistència vers patògens de gran importància econòmica com Magnaporthe oryzae i Fusarium verticillioides. S’ha purificat una carboxipeptidasa de M. oryzae mitjançant cromatografia d’afinitat i posteriorment s’ha caracteritzat per espectrometria de masses. Aquesta proteïna fúngica resulta ser una nova carboxipeptidasa B (MoCPB) que és totalment inhibida pel PCI. En conjunt, aquests resultats indiquen que el PCI exerceix la seva activitat antifúngica mitjançant la inhibició d’aquesta carboxipeptidasa fúngica.

A la segona part de la tesi, s’ha demostrat que l’expressió constitutiva en arròs del gen AtNPR1 d’Arabidopsis confereix resistència front els patògens fúngics M. oryzae i F. verticillioides, i el patogen bacterià Erwinia chrysantemi. S’ha determinat que la resistència observada vers M. grisea, està associada a un augment en la capacitat de la planta per activar els mecanismes endògens de defensa en condicions d’infecció, concretament l’expressió dels gens de defensa PR-1b, TLP (PR-5), Sci1 (PR-6), PR-10 i PBZ. Les plantes transgèniques AtNPR1 crescudes en condicions d’hivernacle presenten un tamany menor i produeixen menys llavors que les plantes no transformades. Les plantes AtNPR1 desenvolupen lesions espontànies a les fulles al ser crescudes en condicions de baixa intensitat de llum. Aquestes lesions van acompanyades d’una sèrie d’efectes citològics com són l’acumulació de l’ió superòxid i de compostos fluorescents en la paret cel·lular, fenòmens que mimetitzen la resposta hipersensible de defensa. Contràriament a la resistència observada vers patògens fúngics i bacterians, les plantes d’arròs AtNPR1 presenten una major susceptibilitat al Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). A més, l’expressió constitutiva del gen AtNPR1 regula negativament l’expressió de gens que participen en la resposta a estrès salí i sequera, com són els gens rab21, salT i dip1, resultant en una major sensibilitat a aquests dos tipus d’estrès abiòtics. Aquestes observacions suggereixen que el gen AtNPR1 en arròs presenta tant un paper positiu com negatiu en la resposta de defensa a estressos biòtics i abiòtics.