Estudis de Delta-11 ACIL-CoA dessaturases implicades en la biosíntesi de feromones sexuals de lepidòpters

Abstract

[CAT] En la natura, la comunicació entre espècies o individus d’una mateixa espècie es produeix per l’emissió i captació per part dels diferents individus de compostos específics. Aquests compostos químics poden provocar diferents comportaments. Els compostos químics implicats en la comunicació sexual entre individus de la mateixa espècie s’anomenen feromones. La diversitat molecular dels components de les feromones sorgeix de variacions en un petit nombre d’etapes enzimàtiques conservades. La dessaturació dels èsters de coenzim A dels àcids grassos saturats és una reacció típica en les vies biosintètiques dels lepidòpters.

Es pot definir la dessaturació com una reacció oxidativa que utilitza oxigen de forma molecular. Aquesta reacció està catalitzada per les dessaturases, que son enzims que contenen ferro no hemo. El complex funcional de la dessaturasa està format per tres proteïnes: la dessaturasa, el citocrom b5 i la citocrom b5 reductasa. En aquest complex la dessaturasa es considera que constitueix el pas més lent de la seqüència de reacció.

La dessaturasa juga un paper essencial en la síntesi dels àcids grassos monoinsaturats que formen part de les membranes cel•lulars. Les glàndules feromonals dels lepidòpters contenen una família inusual de dessaturases que introdueixen dobles enllaços amb diferents estereoquímiques en diverses posicions. L’estudi de les dessaturases dut a terme en el grup de treball havia permès la identificació de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la majoria de components de la feromona sexual de l’espècie Spodoptera littoralis. També s’havia estudiat la ruta de biosíntesi de les feromones de les processionàries del pi i del roure.

El treball realitzat ha consistit en l’estudi de l’expressió de les dessaturases de les espècies plaga Trichoplusia ni i Spodoptera littoralis en un sistema heteròleg en llevat utilitzant vectors: constitutiu YEpOLEX i induïble pYEXTHS-BN. Es van introduir en aquests plasmidis els cDNAs que codifiquen per les dessaturases de les espècies T. ni i S. littoralis així com la proteïna quimèrica formada per la dessaturasa de T. ni fusionada a un domini homòleg a citocrom b5 de la dessaturasa de llevat i la pròpia dessaturasa de llevat en el vector constitutiu YEpOLEX. Les construccions corresponents es van expressar en una soca de llevat deficient en desaturases i elongases pròpies. De les soques resultants es va estudiar el perfil d’àcids grassos que es troben en les seves membranes quan aquests llevats creixen en diferents condicions de cultiu. El canvi del doble enllaç de la posició 9 (la natural pel llevat) a la posició 11 (que generen les dessaturases d’insecte) produeix diferències de comportament entre els llevats de manera que no tenen la mateixa capacitat d’adaptació als canvis ambientals que pateixen.

L’estudi dels extractes lipídics per CG-EM dels llevats que expressen la delta-11 dessaturasa de S. littoralis ha permès detectar els compostos diènics E10,E12-tetradecadienoat de metil i E10,Z12-hexadecadienoat de metil, el primer compost és un component principal de la feromona de l’insecte del que no es coneixia l’enzim responsable de la seva biosíntesi. L’aparició d’aquest compost en els extractes permet dir que la dessaturasa de S. littoralis és un enzim bifuncional.

També s’ha abordat la identificació i el clonatge de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la feromona sexual de la processionària del pi. S’ha aconseguit identificar un fragment de DNA que codificaria per una proteïna que podria ésser una acil-CoA dessaturasa. Assaigs d’activitat posteriors han permès identificar aquesta proteïna com una delta-11 acil-CoA dessaturasa. Aquest enzim a més és capaç d’introduir un triple enllaç en la posició 11 de la cadena de l’àcid gras i de donar lloc a un compost diènic amb dobles enllaços en les posicions 11 i 13.

[ENG] In nature, communication between species or individuals of the same species is produced by the emission and perception of different specific chemicals. The chemicals implied in the sex communication between individuals of the same species are called pheromones.

The molecular diversity of pheromone compounds appears to arise from little changes in a few conserved enzymatic steps. Desaturation of saturated fatty acyl coenzyme A esters is a typical reaction in the lepidopteran biosynthetic pathways.Desaturase functional complex is formed for three proteins: the desaturase, a cythochrome b5 reductase and a cytochrome b5.

We have studied the expression of fatty acid desaturases in the pests “Trichoplusia ni” and “Spodoptera littoralis” in an heterologous expression system in yeast using two plasmids: constitutive YEpOLEX and inducible pYEXTHS-BN. In these plasmids we have introduced the cDNAs for the fatty acid desaturases from S. littoralis, T. ni and this last one fused to a domain homologous to the cytochrome b5 from yeast desaturase. We also have worked with the yeast desaturase in the constitutive plasmid YEpOLEX.

The constructs were introduced in a yeast strain desaturase and elongase deficient (“delta-eloI_delta-oleI”). From the resultant yeast strains we have studied the fatty acid profile which is found in their membranes when this yeast strains have been cultured in different conditions. Changing the position of the double bound from the 9th carbon to the 11th produces variations in yeast growth. The analysis of fatty acid profile from yeasts with “S. littoralis” delta-11 desaturase allowed to detect methyl E10, E12-tetradecadienoate and methyl E10, E12-hexadecadienoate. The first one is a compound of the insect pheromonal blend for which the enzyme responsible for its biosynthesis was not known.

In this work we also have tackled identification and cloning of desaturases involved in the sex pheromone biosynthesis from pine processionary moth. We have isolated one DNA fragment which codifies for a acyl-CoA desaturase like protein. Subsequent activity assays have demonstrated this protein has delta-11 desaturase activity. We also could see that “T. pityocampa” is a trifunctional enzyme since it has delta-11 desaturase, acetylenase and delta-13 desaturase activities.