Sobreexpresión, purificación y reconstitución del citocromo b559

Abstract

El citocromo b559 (cytb559) forma parte del centro de reacción del fotosistema II. Está compuesto por dos subunidades: la subunidad ¿, codificada por el gen psbE, y la subunidad ß, codificada por el gen psbF. Ambos genes se encuentran en el genoma cloroplástico. Entre las dos subunidades se encuentra ensamblado un grupo hemo de tipo b, coordinado por dos histidinas, una de cada subunidad. Desempeña un papel estructural dentro del centro de reacción pero a pesar de los numerosos estudios realizados se desconoce si tiene además otras funciones. Con el fin de obtener una gran cantidad de cytb559 para realizar estudios de estructura/función, se sobreexpresaron las subunidades en E. coli por separado. Se sobreexpresaron en forma soluble las subunidades del cytb559 clonadas en el vector pMAL-c2X modificado con un cola de seis histidinas, pero la purificación de éstas no fue completa. Se cambió de estrategia realizando una reconstitución in vitro con las dos subunidades purificadas a partir de los cuerpos de inclusión, que se obtenían después de sobreexpresar las subunidades en el vector pMAL-c2X. Las propiedades espectroscópicas, las señales de EPR y el potencial redox calculado, para el cytb559 así reconstituido, se corresponden con las características del cytb559 nativo. A continuación, se estudió la inserción en la membrana plasmática de E. coli y reconstitución in vivo de las subunidades sobreexpresadas en el vector pMAL-c2X. Se sobreexpresaron las dos subunidades procedentes de remolacha y de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803 y la subunidad ß de maíz. En todos los casos la proteína de fusión se insertaba espontáneamente en la membrana de la bacteria pero únicamente la subunidad ß de Synechocystis era capaz de reconstituirse in vivo en forma de homodímero, con unas características muy similares a las del cytb559 nativo.