Estrategias para expandir la funcionalización de los poliésteres bacterianos

Abstract

[EN]Polyhydroxyalkanoates (PHA) constitute the carbon and energy storage material of certain bacterial species under excess of carbon and nutrient limitation conditions. These polymers are considered a good choice to replace oil-based plastics, especially for value- added applications in the industrial and medical fields, since they are non-toxic, biocompatible and biodegradable materials. They play an important role in the development of novel generation biomaterials with exceptional appealing biomedical applications that include their use as surgical sutures, scaffolds or drug carriers. The capacity to incorporate novel functionalities into PHA confers tremendous versatility to these polymers. The complex structure of the PHA granule can be exploited as a toolbox to display molecules on their surface carrying out specific functions. In this sense, many granule-associated proteins (GAPs) have been employed as anchoring tags to obtain functionalized PHA beads for various applications such as high-affinity bioseparation, enzyme immobilization, diagnostics or cell targeting. In addition, the ability to edit and redirect the cell system through metabolic and genetic engineering tools enables the construction of platforms to produce a huge range of polymers varying their monomer contents and thus affecting thermal and mechanical properties of the material. This approach can be added to the possibility of incorporating functional groups on the lateral chains of the monomers to generate novel functionalities. The combination and optimization of the functionalization strategies from a multidisciplinary approach is the basis to expand the PHAs potentialities for target applications. This Thesis tries to explore and optimize the described tools for the functionalization of PHA materials following in vivo and in vitro techniques to further increase the applicability of these polymers. This has been achieved by following a multidisciplinary approach. The first two chapters explore the structural aspects of the binding of phasin PhaF from Pseudomonas putida KT2440 to different hydrophobic supports by applying various methodologies. Langmuir techniques have demonstrated the surfactant activity of phasin PhaF and its N-terminal domain, BioF, at different hydrophobic-hydrophilic interfaces. Furthermore, both proteins were able to interact with phospholipids suggesting a non-specific binding of the protein to hydrophobic supports. The results obtained increase the potential to apply phasins in combination with other hydrophobic materials. Moreover, the surface-active properties of these proteins make them interesting to be exploited as biosurfactants. Protein structural models provide a good way to predict the hydrophobicity and the hydrophobic moment of an amphipathic protein, which has enabled the design of various structures based on BioF that preserve their affinity for the PHA granule. This affinity was maintained in the absence of other GAPs on the surface of the granule. Based on one of these structures, a novel anchoring tag was designed. The tag developed showed comparable functionalization efficiency and stability on the surface of the PHA granule to the complete BioF.

Nanotechnology has emerged as a promising research field especially for biomedical purposes. This Thesis explores the potential to apply PHA nanoparticles to transport drugs to the lungs. On the one hand, a study of the potential negative effects of naked PHA particles on the pulmonary surfactant biophysical properties was carried out. Pulmonary surfactant is one of the first barriers the nanoparticles will found in the alveoli. Various techniques, such as the Surfactant Adsorption Test (SAT) and the Langmuir plate, demonstrated negligible effects on the adsorption and spreading capacity of pulmonary surfactant in combination with nanoparticles. On the other hand, the possibility to incorporate pulmonary surfactant proteins on the surface of the PHA beads was explored. The hydrophobicity of these proteins would facilitate their immobilization on ahydrophobic support like PHAs. The production of PHA granules and recombinant forms of the pulmonary surfactant protein SP-B at the same time resulted in the functionalization of PHA nanoparticles for their potential use in lung therapy. In the last section, the structural versatility of PHAs has been studied to obtain novel properties and functionalities. Various mutants of the β-oxidation pathway were demonstrated to affect the monomer contents and thus the thermal properties of the polymer. The use of different fatty acids as substrates conducted to a plethora of polymers. An increase of functional groups such as double bonds was observed when feeding a slowdown β-oxidation mutant with unsaturated precursors. Double bonds allow to incorporate functional groups into the polymer. As a proof of concept, a fluorescent group was covalently attached to a polymer containing double bonds. Succesful fluorescent nanoparticles were obtained with this functionalized polymer, what may expand the applicability of this polymer. The multidisciplinary approach applied during this research has proven to be a good strategy to improve the exploitation of the protein network covering the PHA granule and the structural versatility of the PHA family. The results achieved open novel potential applications in various fields that would be interesting to explore in the future.

[ES]Los polihidroxialcanoatos (PHA) constituyen el material de almacenamiento de carbono y energía de ciertas especies bacterianas en condiciones de exceso de carbono y limitación de nutrientes. Estos polímeros se consideran una alternativa interesante para reemplazar los plásticos de origen petroquímico,especialmente para aplicaciones de valor añadido en los campos industrial y médico, ya que son materiales no tóxicos, biocompatibles y biodegradables. Desempeñan un papel importante en el desarrollo de biomateriales de nueva generación con aplicaciones biomédicas excepcionales que incluyen su uso como suturas quirúrgicas, andamios o transportadores de fármacos. La capacidad de incorporar nuevas funcionalidades a los PHA confiere una gran versatilidad a estos polímeros. La compleja estructura del gránulo de PHA se puede explotar como una caja de herramientas para exponer moléculas en su superficie que lleven a cabo funciones específicas. En este sentido, se han empleado numerosas proteínas asociadas a los gránulos (GAPs) como tags de afinidad para obtener partículas de PHA funcionalizadas con diversas aplicaciones, como bioseparación, inmovilización de enzimas, diagnóstico o transporte dirigido. Además, la capacidad de editar y redirigir el sistema celular a través de herramientas de ingeniería metabólica y genética permite la construcción de plataformas a partir de las cuales se pueden producir una amplia gama de polímeros que varían su contenido monomérico y, por lo tanto, sus propiedades térmicas y mecánicas. Este enfoque se puede añadir a la posibilidad de incorporar grupos funcionales en las cadenas laterales de los monómeros para generar nuevas funcionalidades. La combinación y optimización de las estrategias de funcionalización desde un enfoque multidisciplinar es la base para expandir las potencialidades de los PHA en aplicaciones específicas. La presente Tesis trata de explorar y optimizar las herramientas descritas para la funcionalización de materiales de PHA siguiendo técnicas in vivo e in vitro y mejorar la aplicabilidad de estos polímeros. Esto se ha logrado siguiendo un enfoque multidisciplinar. Los dos primeros capítulos exploran los aspectos estructurales de la unión de la fasina PhaF de Pseudomonas putida KT2440 a diferentes soportes hidrofóbicos aplicando varias metodologías. A través del uso de la balanza de Langmuir se ha demostrado la actividad surfactante de la fasina PhaF y su dominio N-terminal, BioF, en diferentes interfases hidrofóbicas-hidrofílicas. Además, se comprobó que ambas proteínas interaccionan con fosfolípidos, lo que sugiere una unión no específica de la proteína a soportes hidrófobos. Los resultados obtenidos incrementan el potencial para aplicar fasinas en combinación con otros materiales hidrofóbicos. Añadido a esto, las propiedades interfaciales de estas proteínas las hacen interesantes para su uso como biosurfactantes. Por otra parte, los modelos estructurales de proteínas constituyen una buena herramienta para predecir la hidrofobicidad y el momento hidrofóbico de una proteína anfipática, lo que ha permitido el diseño de varias estructuras basadas en el módulo BioF que conservan su afinidad por el gránulo de PHA. Esta afinidad se mantuvo en ausencia de otras GAPs en la superficie del gránulo. Sobre la base de una de estas estructuras se diseñó un nuevo tag de afinidad. El tag desarrollado mostró ser eficaz para la funcionalización de gránulos de PHA, así como una gran estabilidad en la superficie de los mismos, de forma similar al BioF completo.

La Nanotecnología se ha convertido en un campo de investigación prometedor, especialmente con fines biomédicos. Esta Tesis explora el potencial de aplicar nanopartículas de PHA para transportar fármacos a los pulmones. Por un lado, se llevó a cabo un estudio de los posibles efectos negativos de las partículas de PHA desnudas en las propiedades biofísicas del surfactante pulmonar, ya que este complejo de lípidos y proteínas es una de las primeras barreras que las nanopartículas encontrarán en los alvéolos. Varias técnicas, como la Prueba de Adsorción de Surfactante (SAT) y la balanza de Langmuir, demostraron efectos insignificantes en la capacidad de adsorción y propagación del surfactante pulmonar en combinación con nanopartículas. Por otro lado, se exploró la posibilidad de incorporar proteínas del surfactante pulmonar en la superficie de partículas o gránulos de PHA. La hidrofobicidad de estas proteínas facilitaría su inmovilización en un soporte hidrofóbico como el PHA. La producción de gránulos de PHA y de formas recombinantes de la proteína del surfactante pulmonar SP-B al mismo tiempo da como resultado la funcionalización de las nanopartículas de PHA para su uso potencial en terapia pulmonar. En la última sección de la Tesis, se ha estudiado la versatilidad estructural de los PHA para obtener nuevas propiedades y funcionalidades. Se demostró que varios mutantes en la β-oxidación afectan el contenido de monómeros y, por lo tanto, las propiedades térmicas del polímero. El uso de diferentes ácidos grasos como sustratos condujo a una gran cantidad de polímeros. Se observó un aumento de los grupos funcionales, como los dobles enlaces, cuando se alimenta un mutante de β-oxidación con un precursor insaturado. Los dobles enlaces permiten incorporar grupos funcionales en el polímero. Como prueba de concepto, se unió covalentemente un grupo fluorescente a un polímero con dobles enlaces. Se obtuvieron así con éxito nanopartículas fluorescentes de este polímero funcionalizado, lo que puede ampliar la aplicabilidad del mismo. El enfoque multidisciplinar aplicado durante esta Tesis ha demostrado ser una buena estrategia para mejorar la utilización de la red de proteínas que cubre el gránulo de PHA y la versatilidad estructural de la familia de PHA. Los resultados obtenidos aquí abren nuevas aplicaciones potenciales en varios campos que será interesante explorar en el futuro.