Interactions of magnetic nanoparticles with proteins, cells and living organisms for magnetic hyperthermia applications

Abstract

En las nanopartículas (NPs) la reducción de tamaño se asocia con nuevas propiedades ópticas, electrónicas, magnéticas y químicas que difieren de las del material masivo. La enorme variedad de formas, tamaños y propiedades físicas y químicas de estos nanomateriales abren nuevas posibilidades para su uso en campos diversos como la electrónica, ingeniería, comunicación, energía, industria textil y medicina entre otros. De entre todas las aplicaciones, el uso de la nanotecnología para el cuidado de la salud representa una gran promesa, para mejorar los tratamientos y terapias existentes a día de hoy. De entre todas las NPs, las de óxido de hierro presentan un gran potencial para su uso en medicina oncológica, debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad, y posibilidad de generar calor cuando están sometidas a un campo magnético alterno. En este trabajo se ha investigado el uso de NPs de óxido de hierro para su posible aplicación en el tratamiento de hipertermia magnética de cáncer. Para ello se investigaron las interacciones de las NPs con proteínas, células, y organismos vivos, tanto invertebrados como vertebrados. En esta tesis, las NPs de óxido de hierro fueron sintetizadas por el método de descomposición térmica y se transfirieron a fase acuosa utilizando un polímero amfífilico modificado con un fluoróforo. Como resultado se han obtenido nanopartículas fluorescentes, monosdispersas y totalmente estables en agua con un alto rendimiento del procedimiento. La funcionalización posterior con moléculas de glucosa o poli(etilenglicol) (PEG) proporcionó estabilidad de las NPs en medios biológicos, permitiendo al mismo su aplicación en futuros estudios in vitro e in vivo. Las NPs funcionalizadas se emplearon para estudiar la respuesta celular y molecular a una hipertermia magnética leve (subletal) en dos sistemas biológicos diferentes: en cultivos celulares in vitro (células de melanoma murino) y en un modelo animal invertebrado, Hydra vulgaris. Se encontró que las NPs internalizaban abundantemente en los dos sistemas, lo que fue confirmado por una variedad de métodos. Por otra parte, la aplicación del campo magnético alterno no provocó la muerte celular, alteración del ciclo celular ni otros efectos tóxicos ni en las células ni en los animales. Sin embargo, a nivel molecular en ambos casos se detectó la expresión elevada del mRNA del gen que codifica para la proteína de choque térmico hsp70, lo que sugiere un mecanismo general en la respuesta de las células eucariotas sujetas a dosis subletales térmicas. Además, este aumento de expresión de hsp70 bajo el campo magnético alterno se observó sin sobrepasar nunca la temperatura fisiológica de las células, lo que implica que las NPs se comportan como “nanoestufas” dentro de las células. La hipótesis de que las NPs se comportan como “nanoestufas” en respuesta al campo magnético tiene lugar en ambos modelos biológicos. Por otra parte, ha sido posible correlacionar esta expresión de hsp70 tras aplicación de hipertermia magnética con la expresión de hsp70 producida tras calentar las células de manera externa en un incubador. En ambos modelos biológicos la expresión de hsp70 se correlaciona con un aumento de temperatura de 12 °C, lo que da pie a usar esta estrategia como termómetro molecular para deducir el cambio de temperatura que tiene lugar en el interior de la célula al aplicar el campo magnético alterno.

Posteriormente se investigaron las interacciones de las NPs con proteínas de suero, con el propósito de estudiar su implicación en la internalización celular, la biodegradación y la posibilidad de liberar fármacos. Se elaboró un protocolo para el seguimiento simultáneo de NPs y proteínas dentro de las células, lo que confirmó que ambos se internalizan como un complejo en el interior de las células y finalmente se acumulan en los lisosomas. Interesantemente, se encontró que las proteínas proporcionan una protección contra la degradación en los lisosomas de las NPs. Posteriormente se unió en las NPs de manera inespecífica un fármaco modelo y se estudio el impacto de las interacciones de las proteínas con este complejo. Hay que resaltar que las proteínas actúan como un detergente eliminando parte del fármaco adsorbido, lo que podría tener consecuencias en fármacos adsorbidos a NPs y administrados por vía intravenosa, ya que en contacto con las proteínas de la sangre podrían ser separados. Sin embargo, se encontró que la acción combinada de las proteínas y el calor provocan una liberación del fármaco mayor, lo que da pie al uso de estas NPs con proteínas en terapias de liberación de fármacos al aplicar un campo magnético alterno. Posteriormente, se investigó el comportamiento de las NPs funcionalizadas con glucosa o PEG después de la administración intravenosa in vivo. La dosis administrada de las NPs no causó ningún efecto tóxico ni a corto (72 horas) ni a largo plazo (4 meses), pero se encontró que el destino de las NPs depende mayoritariamente de la modificación de la superficie y por lo tanto de la composición de las proteínas que se adsorben en sangre (corona de proteínas) y que fueron investigados por la espectrometría de masas. La funcionalización con moléculas de PEG dio como resultado la adsorción de una menor cantidad de opsoninas y por tanto una circulación en la sangre más prolongada, que se manifestó en la distribución de las NPs en todos los órganos analizados, incluyendo el timo y los órganos reproductores. A su vez, la funcionalización de la superficie con glucosa resultó en la adsorción de una mayor cantidad de opsoninas y el rápido reconocimiento de las NPs por el sistema fagocítico mononuclear (SFM), principalmente el hígado y el bazo. El destino de las NPs fue analizado por distintas técnicas, incluyendo microscopia de fluorescencia, medidas magnéticas y microscopia electrónica. Las medidas magnéticas demostraron que después de cuatro meses las NPs@PEG sufrieron una desagregación y/o reducción completa del tamaño, mientras que para las NPs@glc esta biotransformación no fue completa. Sin embargo, en medidas realizadas in vitro, estos resultados fueron contrarios. Además, la cinética de degradación fue diferente en el hígado y el bazo, dependiendo del tipo de la NP. Por lo tanto, las moléculas unidas (glucosa o PEG) y la corona de proteínas asociada pueden influir en el proceso de biotransformación. Así, en este proceso la corona de proteínas puede contribuir indirectamente haciendo que las NPs se acumulen en células diferentes o con diferente densidad en los lisosomas; o directamente, ya que las proteínas también pueden influir en la velocidad de degradación de las NPs mediante el control del acceso de las enzimas

lisosomales hasta el núcleo de la NP. Por último, se investigó la posible aplicación de las NPs usadas en este trabajo para el tratamiento con hipertermia magnética de tumores en ratones. De manera similar a los datos de la literatura, se encontró que la acumulación en el tumor a través del efecto pasivo sólo se dio para las NPs funcionalizadas con PEG y solo de manera escasa, lo que inhabilitaba una posterior aplicación de hipertermia magnética. Se cambió por tanto el enfoque, inyectando directamente las NPs dentro del tumor. La aplicación del campo magnético alterno resultó en una reducción estadísticamente significativa del tamaño de los tumores en comparación con los animales no tratados, pero solamente en el caso de animales con tumores en la fase inicial de su desarrollo. Todos estos resultados sugieren que las NPs empleadas en este trabajo podrían emplearse en terapias adyuvantes para el tratamiento del cáncer, aunque son necesarios estudios complementarios para conocer el destino final de la NPs en el tumor (células tumorales o macrófagos) y mejorar la biodistribución de las NPs en el mismo.