Análisis proteómico preliminar de antígenos de excreción-secreción y tegumento de adultos de Dicrocoelium dendriticum

Abstract

[ES]Dicrocoelium dendriticum, trematodo hepático causante de la dicroceliosis, afecta al hígado, vesícula biliar y conductos biliares de rumiantes domésticos y silvestres y, ocasionalmente, infecta al hombre. Aunque dicha parasitosis está ampliamente distribuida, su impacto sanitario y económico no ha sido cuantificado convenientemente, por una parte, debido a la naturaleza subclínica de la enfermedad y, por otra, a la carencia de un método inmunológico estandarizado, sensible y específico de diagnóstico in vivo. En este sentido, la identificación y caracterización de proteínas antigénicas específicas, implicadas en la interacción parásito-hospedador definitivo, constituye un requisito indispensable para el diagnóstico inmunológico y para su posible utilización como dianas vacunales. El objetivo del presente trabajo es el análisis de los proteomas de extractos de excreción-secreción y tegumento de vermes adultos de D. dendriticum. El antígeno excretor-secretor se obtuvo a partir de la incubación de adultos vivos (40 vermes/ml) en RPMI-1640 durante 24 horas, según el protocolo establecido por Revilla-Nuín et al. (2005). El extracto tegumentario se recolectó tras la incubación de un número elevado de vermes vivos (700 a 1000) en TBS-Triton X-100 1%, durante 30 min, a 4º C y 70 rpm. Con el fin de mejorar la resolución de las proteínas y eliminar posibles moléculas contaminantes, ambos extractos se trataron de dos maneras diferentes: 1/ Precipitación con TCA-acetona; 2/ Utilización del kit ReadyPrepTM 2-D Cleanup (Bio-Rad). Posteriormente, se sometieron a electroforesis 2D. En la primera dimensión se utilizaron tiras IPG de 7 cm, en gradiente de pH 3-10, cargadas con 60 a 100 µg proteína/tira. La segunda dimensión se realizó en minigeles de poliacrilamida al 10 ó 12%, teñidos posteriormente con Coomassie Colodial. Se seleccionaron 15 spots mayoritarios en cada uno de los extractos antigénicos y se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Para la identificación de las proteínas se empleó el motor de búsqueda MASCOT y la base de datos NCBInr.

El extracto de excreción-secreción se resolvió en numerosos spots con pesos moleculares entre 9 y 84 kDa y puntos isoeléctricos (pI) entre 4 y 9. De los 15 spots analizados, mediante MALDI, únicamente se ha podido establecer homología para 8 de ellos, que se corresponden con 6 proteínas diferentes. Una de ellas, identificada en 3 spots, presenta similitud en el 36% de su secuencia con la mioglobina de D. dendriticum. El mapa proteómico del extracto de tegumento reveló que la mayoría de las proteínas presentaban pIs de 5,5 a 9, en un rango de pesos moleculares de 10 a 110 kDa. De los 15 spots analizados por MALDI TOF/TOF se pudieron identificar 12, que presentaban homología con 7 proteínas distintas. De ellas una se corresponde con 1 proteína del hospedador (pre-pro albúmina sérica) y otra fue identificada como mioglobina en 4 spots, 3 de los cuales estaban también presentes en el extracto de excreción-secreción. En conclusión, los proteomas de antígeno excretor-secretor y de tegumento revelan similitud, tanto en lo que respecta al número de spots como a su distribución en el rango de pesos moleculares y puntos isoeléctricos. Por espectrometría de masas MALDI TOF/TOF se identificaron 12 proteínas diferentes, de las cuales al menos 1 procede del hospedador. Finalmente, hay que señalar que, es necesario profundizar en los estudios proteómicos, tanto para completar la identificación de las proteínas como para determinar las de mayor poder antigénico e inmunogénico.

[EN]Dicrocoelium dendriticum, the hepatic trematode responsible for dicrocoeliosis, affects the liver, gall bladder and bile ducts of domestic and wild ruminants and, also occasionally, infects humans. Although this parasitosis is widely distributed, its sanitary and economic impact has not been properly quantified, on the one hand due to its subclinical nature and, on the other hand, due to the lack of a standardized immunological, sensitive and specific diagnostic method in vivo. The identification and characterization of specific antigenic proteins involved in the parasite-definitive host interplay becomes an essential requirement for immunological diagnosis and for their possible use as vaccination targets. The objective of the present work is the proteomic analysis of the excreted-secreted proteins and the tegumental proteins of D.dendriticum adult worms. The excretory-secretory antigen was obtained after incubation of live adults (40 worms/ml) in RPMI-1640 during 24 h, according to the protocol established by Revilla-Nuín et al. (2005). The tegumental extract was collected after incubating of a higher number (700 to 1000) of live worms in TBS-Triton X-100 1% during 30 min at 4º C and 70 rpm. To improve protein resolution and remove possible contaminant particles, both extracts were treated in two different ways: 1/ TCA-acetone precipitation; 2/ ReadyPrepTM2-D Cleanup kit (Bio-Rad). When this process was completed, 2-D electrophoresis was applied. On the first dimension we used 7 cm IPG strips, with a pH gradient from 3 to 10, charged with 60-100 µg protein/strip. The second dimension was performed on 10-12% polyacrylamide minigels which were later stained with Coloidal Coomassie. The 15 major spots were chosen and analyzed by MALDI TOF/TOF mass spectrometer. In order to identify different proteins, MASCOT software and NCBInr database were used.

The excretory-secretory extract revealed numerous spots located between 9 to 84 kDa and isoelectric points (pI) from 4 to 9. From the 15 spots analyzed by MALDI, homology could only be established for 8 of them, which were matched with 6 different proteins. One of them, which was identified in 3 spots, showed similarity on 36% of its sequence with D. dendriticum myoglobin. The proteomic map of tegumental extract revealed that most of the proteins showed pI from 5.5 to 9 with a molecular weight between 10 and 110 kDa. Fifteen spots were analyzed by MALDI TOF/TOF, and only 12 were identified, which showed homology with 7 different proteins. One of them was matched with a host protein (pre-pro serum albumin) and another was identified as myoglobin in 4 spots, 3 of them were also found in the excretion-secretion extract. In conclusion, the proteomes of excretory-secretory and tegument antigens revealed similarity both in the number of spots and in their distribution on the molecular weight and isoelectric point ranges. Twelve different proteins were identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometry, at least one of them had a host origin. Finally, proteomic studies need to be deeper as well to complete the protein identifications and to determine those with the higher antigenic or immunogenic power.