Producción heteróloga y caracterización bioquímica de una α-D-galactosidasa de Lactobacillus plantarum WCFS1

Abstract

[ES]: La α-galactosidasa (E.C.3.2.1.22) es una exo-glicosidasa que escinde principalmente residuos terminales α-1,6-D-galactosilo unidos a una amplia gama de sustratos incluyendo oligosacáridos de azúcares de la familia de la rafinosa. Algunas de las αgalactosidasas son también conocidas por catalizar reacciones de transgalactosilación, especialmente a una alta concentración de sustrato. El interés de esta enzima se deriva de sus potenciales aplicaciones tecnológicas y medicinales. Con el objeto de encontrar nuevas enzimas con propiedades y características interesantes, en este trabajo se caracterizó la glicosidasa Lp_3485 de la bacteria láctica Lactobacillus plantarum WCFS1. Se procedió a la producción heteróloga en Escherichia coli, la purificación y la caracterización de la proteína Lp_3485. El gen se clonó mediante un método de clonación independiente de ligación (LIC) en un vector de expresión que añade una etiqueta de polihistidina para su posterior purificación por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). Se obtuvo una proteína de 83.6 kDa con actividad frente al 4-nitrofenil-α-D-galactopiranósido. La proteína mostró una actividad específica αgalactosidasa de 2.56 U/mg y una eficacia catalítica de 1840.92 mM-1 min-1. Las condiciones óptimas de reacción se encuentran por debajo de los 30℃ (manteniendo más de un 50% de actividad relativa a 22℃), y en un intervalo de pH de 4.0 a 6.5. La actividad α-galactosidasa de la proteína Lp_3485 se vio fuertemente inhibida por la presencia de Hg2+ y Cu2+, y favorecida por la presencia de Fe2+, Tritón-100, Tween 20, β-mercaptoetanol y el EDTA.

[EN]: α-galactosidase is an exo-glycosidase that mainly cleaves terminal α-1,6-linked Dgalactosyl residues from a wide range of substrates including oligo-saccharides of raffinose family. Some of the α-galactosidases are also known for catalyzing transgalactosylation reactions especially at a high concentration of substrate. Interest in this enzyme is due to its potential technological and medicinal applications. With the aim to find novel enzymes with interesting features, we have characterized the Lp_3485 glycosidase from the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum WCFS1. The Lp_3485 protein was produced in Escherichia coli by heterologous production, purificated and biochemicaly characterized. The gene was cloned by a ligation-independent cloning (LIC) method into an expression vector which added a polyhistidine tag for further purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). A 83.6 kDa protein with activity on 4-notrophenyl-α-D-galactopiranoside was obtained. The Lp_3485 protein showed a specific α-galactosidase activity of 2.56 U/mg and a catalytic efficiency of 1890.42 mM-1 min-1. Optimal reaction conditions were below 30℃ (maintaining more than 50% of its activity at 22℃) and in pH range between 4.0 and 6.5. Lp_3485 protein’s α-galactosidase activity of the Lp_3485 protein was strongly inhibited by the presence of Hg2+ and Cu2+, and increased by the presence of Fe2+, Triton-100, Tween 20, β-mercaptoetanol and EDTA.