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Título

Organización bioquímica del proto-anillo de división bacteriano en sistemas mínimos de membrana-impacto del sistema MinCDE de selección del sitio de división.

AutorRaso, A.
DirectorRivas, Germán
Palabras claveBioquímica
Biofísica
Biología sintética
Interacciones macromoleculares
FtsZ
Fecha de publicación2018
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Bacterial cell division in E. coli is mediated by a multiprotein machine whose elements interact dynamically at midcell to form the division ring, a structure that drives cytokinesis forming part of the divisome. The first macromolecular assembly of the divisome is the proto-ring, comprising three proteins – FtsZ, FtsA, and ZipA – that associate at the cytoplasmic membrane forming the scaffold structure into which the rest of the essential division proteins are incorporated. FtsZ is a GTPase and its polymerization is closely related to the binding and hydrolysis of GTP. ZipA contains a short amino-terminal region integrated in the membrane and connected to the globular carboxy-terminal domain (through which it interacts with the FtsZ central hub) by a flexible, unstructured linker region. FtsA is an actin-like protein, with a short amphipathic helix that mediates its association to the membrane. The position of the ring at midcell is highly regulated by several negative control systems that inhibit its incorrect formation. One of them involves the self-oscillating MinCDE protein complex, which oscillates from pole to pole, blocking polymerization of FtsZ at both poles. As the assembly of the proto-ring complex in vivo takes place at the inner bacterial membrane, a considerable effort has been (and is being) made to study the assembly properties of FtsZ and its interaction with companion proteins in reconstructions of the proto-ring structured as biomimetic membrane systems. Among them, supported lipid bilayers (SLBs) are well suited to investigate the reactivity (i.e. dynamic interactions) and the membrane structural organization of division proteins by surface sensitive imaging techniques, under biochemically controlled and well-defined experimental conditions. Following this bottom-up strategy, co-reconstruction of the highly dynamic Min proteins on SLBs in vitro has revealed that this complex self-organizes in wave-like patterns, powered by ATP hydrolysis, that travel across the membrane surface. These “waves” exhibit many features of the Min oscillations observed in vivo. In addition, the co-reconstitution of FtsZ and FtsA on supported bilayers has shown that FtsA promotes the self-organization of FtsZ fibbers into dynamic patterns, giving rise to coordinated streams and swirling rings with preferential direction. The main aims in the present thesis can be summarised as follows: I. Self-organization of membrane-tethered FtsZ in flat supported membranes (Section 4) to understand the mechanisms governing the emergence and steady-state dynamics of FtsZ chiral vortices in supported bilayers. II. Co-reconstitution of FtsZ-MinCDE complexes in ZipA-containing supported membranes (Section 5) to address the question of how the MinCDE complex regulates the behaviour of FtsZ polymers tethered to the membrane by the proto-ring element ZipA. III. Co-reconstitution of FtsZ-FtsA-MinCDE complexes in supported membranes (Section 6) to respond to the question of how FtsA influences the coupling between FtsZ polymers and MinCDE complex.
To study the intrinsic role of FtsZ in the formation of dynamic patterns, we thus have revisited the in vitro reconstitution of the membrane-targeted chimeric FtsZ variant, FtsZ-YFP-mts, to flat supported membranes (Section 4). Our results have demonstrated that under specific conditions the formation of dynamic vortices is intrinsic to FtsZ and thus, the membrane adaptor FtsA is not required for the emergent spatial self-organization dynamics of FtsZ. In addition, this ring formation has only been observed within a narrow range of protein concentrations at the bilayer which is highly modulated by free magnesium and depends upon GTP hydrolysis. Intriguingly, the direction of rotation can be reversed by switching the membrane targeting sequence from the C-terminus to the N-terminus of the protein, implying that the filament attachment must have a perpendicular component to both, curvature and polarity. Remarkably, this chirality switch concurs with previously shown inward or outward membrane deformations by the respective FtsZ mutants. Our results lead to suggest an intrinsic helicity of FtsZ filaments with more than one direction of curvature, supporting earlier hypotheses and experimental evidence. The specific question addressed in Section 5 is how the Min system can dynamically modulate the FtsZ polymer network in ZipA-containing bilayers. Our results have determined that the dynamic pattern formation of the Min system modulates the spatial organization of FtsZ polymer networks in membrane-like environments, revealing the anti-correlated coupling between the two systems. The formation of these dynamic FtsZ wave-like patterns required the anchoring of FtsZ filaments to the membrane via ZipA, as well as the recruitment to the membrane of MinC, the element of the Min system that partially impairs FtsZ assembly. Our results can be explained if MinC, when complexed to MinD, has a higher affinity for the central hub of FtsZ than ZipA, which results in the displacement of FtsZ polymers from the membrane. Our coupling assays further revealed that both ZipA surface density and crowding enhance the coupling between the Z-network and the Min system, as shown by the increase in wave modulation. In this section, we have provided evidences suggesting that ZipA, in addition to its role in proto-ring stability, has a central role in the coupling between the self-oscillating Min system and the remodelling of FtsZ polymers at the early stages of division in E. coli, thus contributing to the efficient selection of the division site.
The effect of FtsA protein in the coupling between FtsZ polymers and MinCDE complex in supported lipid bilayer has been analysed in Section 6. Firstly, we have optimized the protocol of FtsA purification allowing us to obtain a soluble and active protein, which exists as a mixture of monomers and oligomeric species, and binds membrane lipids with moderate affinity. FtsA-FtsZ self-organization assays on flat supported membranes show that these proteins assemble into dynamic chiral vortices. Co-reconstitution of FtsZ-FtsA- MinCDE complexes resulted in co-migrating MinCDE-FtsZ waves, as revealed by confocal microscopy, similar to the ones previously observed when FtsZ was free in solution in the absence of membrane tethering elements. This behaviour contrasts with the FtsZ polymers waves driven by MinCDE when FtsZ is associated to the membrane by ZipA. These findings suggest that the susceptibility of FtsZ polymers to spatial regulation by MinCDE – driven by MinC - depends on the nature of the FtsZ tethering element, being FtsA or ZipA. Therefore, the dynamic distribution of FtsZ controlled by the MinCDE system is different depending upon which proto-ring protein anchors FtsZ to the membrane. Finally, preliminary results using micro-compartments to reconstruct the MinCDE system together with FtsA-FtsZ filaments have revealed that the spatial confinement of the divisome proteins plays a crucial role in their dynamic behaviour since anti-correlated oscillations from pole to pole of the micro-compartments were found, in contrast with that observed in flat membranes.
[ES] La división celular bacteriana en E. coli está mediada por una maquinaría multiproteica (divisoma) cuyos componentes se ensamblan dinámicamente en el punto medio de la célula para formar el anillo de división, el cual desencadena la citocinesis bacteriana. El primer complejo macromolecular del divisoma es el proto-anillo constituido por tres proteínas, FtsZ, FtsA y ZipA, que se asocian a la membrana citoplasmática formando la estructura de andamiaje a la que se incorporan el resto de las proteínas esenciales de división. FtsZ es una GTPasa y su mecanismo de polimerización está estrechamente relacionado con la unión e hidrólisis de GTP. ZipA se estructura en un dominio transmembrana amino-terminal y un dominio globular C-terminal (zona de interacción con el central hub de FtsZ), conectados ambos por un segmento flexible. La proteína FtsA presenta homología estructural con la actina y consta de una corta hélice anfipática que permite su anclaje a la membrana. El posicionamiento del anillo Z está estrechamente regulado mediante varios sistemas de control negativo, con el fin de inhibir su incorrecta localización en la membrana bacteriana. Uno de ellos es el complejo de proteínas MinCDE, el cual oscila de polo a polo de la célula, bloqueando la polimerización de FtsZ en dichos polos. El ensamblaje del proto-anillo in vivo tiene lugar en la membrana bacteriana interna, por ello se ha realizado (y se sigue haciendo) un esfuerzo considerable para estudiar las propiedades de ensamblaje de FtsZ y su interacción con el resto de proteínas del divisoma, reconstruyendo el proto-anillo en sistemas biomiméticos de membrana. Entre ellos, las bicapas lipídicas soportadas (SLBs) constituyen un sistema adecuado para investigar la reactividad (es decir, las interacciones dinámicas) y la organización estructural de las proteínas de división en la membrana, mediante técnicas de imagen sensibles a la superficie, bajo condiciones experimentales bien definidas y bioquímicamente controladas.
Siguiendo esta estrategia bottom-up, la co-reconstitución in vitro de las proteínas MinCDE en SLBs ha revelado que este complejo se auto-organiza formando patrones oscilatorios, mediados por la hidrólisis de ATP, que viajan a través de la superficie de la membrana. Estas "ondas" poseen muchas características observadas en las oscilaciones de las proteínas Min in vivo. A su vez, la reconstitución de FtsZ y FtsA en bicapas lipídicas soportadas ha demostrado que FtsA promueve la auto-organización de fibras de FtsZ originando patrones dinámicos y anillos que giran con una dirección preferencial. Los objetivos generales de esta tesis se resumen a continuación: I. Autoorganización de la variante de FtsZ que se auto-ensambla a la membrana en bicapas soportadas planas (Sección 4), para comprender los mecanismos que gobiernan la aparición y la dinámica del estado estacionario de los vórtices quirales de FtsZ en bicapas soportadas. II. Co-reconstitución de los complejos FtsZ-MinCDE en membranas con ZipA integrada (Sección 5), para abordar la cuestión de cómo el complejo MinCDE regula el comportamiento de los polímeros de FtsZ anclados a la membrana a través del elemento del proto-anillo ZipA. III. Co-reconstitución de los complejos FtsZ-FtsA-MinCDE en membranas soportadas (Sección 6), para responder la pregunta de cómo FtsA influye en el acoplamiento entre los polímeros de FtsZ y el complejo MinCDE. Con el fin de estudiar el papel intrínseco de FtsZ en la formación de patrones dinámicos, hemos revisado la reconstitución in vitro de la variante quimérica de FtsZ que se auto-ensambla a la membrana, FtsZ-YFP-mts, en membranas soportadas planas (Sección 4). Nuestros resultados han demostrado que, bajo condiciones específicas, la formación de vórtices dinámicos es intrínseca a FtsZ y, por lo tanto, el anclaje de FtsZ a la membrana a través de FtsA no es estrictamente necesario para la dinámica de auto-organización espacial de FtsZ. Además, la formación de anillos dinámicos solo se ha observado dentro de un estrecho intervalo de concentración de FtsZ en la bicapa, lo cual depende de la concentración de magnesio libre y de la hidrólisis de GTP. La dirección de rotación de dichos anillos puede invertirse al cambiar la posición de la secuencia de anclaje a membrana del extremo C-terminal al N-terminal de la proteína. Esto implica que la secuencia de unión a membrana de FtsZ debe tener un componente perpendicular tanto a la curvatura como a la polaridad del filamento de FtsZ. La opuesta quiralidad de los anillos cuando la secuencia de anclaje a membrana se posiciona en un extremo u otro de la proteína concuerda con las deformaciones de membrana hacia dentro o hacia fuera observadas previamente por las variantes quiméricas de FtsZ. Nuestros resultados sugieren que los filamentos de FtsZ muestran una naturaleza helicoidal intrínseca con más de una dirección de curvatura, lo cual respalda las hipótesis anteriores y es coherente con el trabajo experimental. En la Sección 5 se ha pretendido conocer cómo el sistema Min puede modular dinámicamente la red de polímeros de FtsZ en bicapas con ZipA integrada. Los resultados obtenidos han revelado que la formación de patrones dinámicos del sistema Min modula la organización espacial de las redes de polímeros de FtsZ en entornos biomiméticos de membrana, revelando el acoplamiento anti-correlacionado entre los dos sistemas. La formación de dichos patrones dinámicos requiere tanto el anclaje de los filamentos de FtsZ a la membrana a través de ZipA como el reclutamiento a la membrana de MinC, responsable de inhibir la formación del anillo Z. Estos resultados pueden ser explicados si MinC, al formar complejo con MinD, muestra una mayor afinidad por el central hub de FtsZ que ZipA, originando la exclusión de los polímeros de FtsZ de la membrana.
A su vez, el incremento de la densidad superficial de ZipA y la formación de redes de polímeros de FtsZ en presencia de Ficoll 70 favorecen el acoplamiento entre las ondas de Min y las de FtsZ, dando como resultado un mayor desplazamiento de FtsZ, en zonas donde la concentración de MinC es máxima. Estos resultados demuestran que la formación de ondas dinámicas del sistema Min es suficiente para modular la organización espacial de los polímeros de FtsZ en sistemas mínimos de membrana, revelando el acoplamiento entre los dos sistemas. Por último, en esta sección hemos proporcionado evidencias que sugieren que ZipA, además de su papel en la estabilidad del proto-anillo, tiene un papel central en el acoplamiento entre el sistema Min y la reorganización de los polímeros de FtsZ en las primeras etapas de la división de E. coli, contribuyendo así a la eficiente selección del sitio de división. El efecto de la proteína FtsA en el acoplamiento entre los polímeros de FtsZ y el complejo MinCDE en bicapas lipídicas soportadas ha sido analizado en la Sección 6. En primer lugar, hemos optimizado el protocolo de purificación de FtsA, lo que nos ha permitido obtener una proteína soluble y activa, que existe como una mezcla de monómeros y especies oligoméricas, y que se une a los lípidos de membrana con una afinidad moderada. Los ensayos de auto-organización de FtsA-FtsZ en membranas soportadas planas muestran que estas proteínas se auto ensamblan originando vórtices dinámicos y quirales. La reconstitución de los complejos FtsZ-FtsA-MinCDE en membranas lipídicas soportadas permitió la detección mediante microscopía confocal de ondas MinCDE-FtsZ dinámicas que migran conjuntamente. Dicho comportamiento es similar al observado previamente, cuando FtsZ permanecía libre en solución en ausencia de elementos de anclaje a la membrana. Sin embargo, este resultado difiere del acoplamiento observado cuando FtsZ está asociado a la membrana por ZipA, donde las ondas de los polímeros de FtsZ impulsadas por MinCDE se detectaron en anti-fase respecto a las del complejo Min. Estos hallazgos sugieren que la susceptibilidad de los polímeros de FtsZ a la regulación espacial mediante el sistema Min, impulsada por el efecto de MinC, depende de la naturaleza del elemento de anclaje de FtsZ a la membrana (FtsA o ZipA). Por lo tanto, la distribución dinámica de FtsZ mediada por el sistema MinCDE es alterada en función de la proteína del proto-anillo que ancle FtsZ a la membrana. Finalmente, la reconstitución del sistema MinCDE junto con los filamentos FtsA-FtsZ en micro-compartimentos ha permitido determinar de forma preliminar que el confinamiento espacial de las proteínas del divisoma desempeña un papel crucial en su comportamiento dinámico. El acoplamiento de los sistemas FtsZ-MinCDE detectado dentro de los micro-compartimentos fue en anti-fase, en contraposición con lo observado en membranas planas.
Descripción150 p.-56 fig.-1 tab.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/167496
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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