Biotransformación bacteriana de esteroides

Abstract

[EN] 1. Introduction Steroid compounds are a family of molecules of great biological importance due to their abundance in nature and their participation in a wide range of cellular and physiological functions in different organisms (Lednicer, 2011; Nelson and Cox, 2012). Since the mid-twentieth century, the number of steroid molecules has increased considerably due to the chemical synthesis of a large number of xenobiotic compounds with different pharmacological properties. The study of microbial pathways of steroid degradation has aroused great interest in the scientific community in recent decades, driven by the abundance of natural steroids and the considerable increase of xenobiotic steroid contaminants in the environment (García et al., 2012). A considerable number of these studies have been performed with Actinobacteria (Actinomycetes) and in particular, with representatives of the suborder Corynebacterineae such as Mycobacterium, Rhodococcus and Gordonia. These genera include pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis or Rhodococcus equi, and non-strictly pathogenic or saprophyte bacteria such as Mycobacterium smegmatis, Gordonia neofelifaecis and Rhodococcus jostii. The most important advances in this field have been achieved in the study of cholesterol catabolism, largely due to the role of this molecule in the pathogenesis of M. tuberculosis. However, actinobacteria usually contain several gene clusters involved in the steroid catabolism, which confer on them the ability to mineralize a wide range of steroids (e. g., sterols, bile acids, testosterone, progesterone). The complexity of the steroid molecules and consequently of their degradation processes makes the study of these pathways especially difficult. On the other hand, microbial biocatalysts have been used for decades to facilitate the synthesis of new steroid molecules in the pharmaceutical industry (Donova and Egorova, 2012). For this purpose, different environmentally isolated microorganisms improved by means of conventional random mutation and selection techniques have been traditionally used in biotransformation processes. However, it has recently begun to explore the implementation of Metabolic Engineering and Synthetic Biology approaches for the development of improved biocatalysts à la carte. In this way, in recent years there has been a convergence of interests between the study of steroid catabolic pathways and the design of biocatalysts á la carte for industrial purposes. This Doctoral Thesis is part of this new experimental approach. 2. Objectives and results: Two general objectives were proposed at the beginning of this Doctoral Thesis: 1. Investigate the steroid catabolism in the bacterium M. smegmatis, which has been proposed as a metabolic model for the study of cholesterol catabolism in actinobacteria.

2. Investigate the potential of M. smegmatis as a microbial cell factory for the production of steroids of industrial interest. In relation to the first objective of this Doctoral Thesis, the mineralization of the C-19 steroids androst-4-ene-3,17-dione (AD), androst-1,4-diene-3,17-dione (ADD) and 9α-hydroxy-4 androstene-3,17-dione (9OH-AD), postulated as intermediates of the cholesterol catabolism in actinobacteria, has been studied in M. smegmatis. Contrary to what might be expected, this bacterium cannot use the C-19 compounds as the sole carbon and energy source. Only the ΔkstR mutant, which constitutively expresses the cholesterol catabolic genes regulated by the KstR repressor, metabolizes AD and ADD with certain difficulties, but not 9OH-AD, suggesting that these compounds are not true intermediates of the cholesterol catabolic pathway. From these studies, different mutants of M. smegmatis metabolizing efficiently all the C-19 steroids were identified mapped in the MSMEG_2868 gene, which encodes a PadR-type regulator. These mutants constitutively express a group of genes called C-19+ cluster (MSMEG_2851 to MSMEG_2901), which encodes different steroid metabolizing enzymes that remain essentially inactive under conventional culture conditions. These genes are responsible for the mineralization of C-19 steroids in the PadR mutants. The C-19+ cluster have apparently evolved independently from the upper cholesterol kstR-regulon, but both clusters converge on the lower cholesterol kstR2-regulon responsible for the metabolism of the C and D steroid rings. Homologous C-19+ clusters have been identified in other actinobacteria that metabolize steroids, but remarkably it is absent in M. tuberculosis. The identification of this new gene cluster has allowed the discovery of new enzymatic activities of industrial interest (e. g., 3-keto-steroid-Δ1-dehydrogenase, KstD; 3-ketoesteroid-9α-hydroxylase, KSH) and has opened the door to design of more robust biocatalysts for the steroid production. In relation to the second objective, the previous knowledge has been applied to the utilization of M. smegmatis as a microbial cell factory for the steroid production. The use of this model bacterium has been investigated in three processes of industrial relevance: (i) production of 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione from sterols, (ii) production of testosterone, (iii) Δ1,2-dehydrogenation and 9α-hydroxylation of 3-ketoesteroids. The results obtained have provided the proofs of concept that support the use of M. smegmatis as an ideal biocatalyst for the implementation of Metabolic Engineering and Synthetic Biology in the development of industrial bioprocesses for the production of steroids à la carte.

3. Conclusions: • It is necessary to reformulate the catabolism of sterols in actinobacteria and in particular, in M. smegmatis. The results support the hypothesis that the steroid side-chain and the A-B rings degradation occurs simultaneously during the sterol catabolism and therefore the compounds AD, ADD or 9OH-AD are not true intermediates of the cholesterol catabolic pathway. • A new C-19 steroid catabolic pathway named the C-19+ pathway has been identified in M. smegmatis, converging with the cholesterol pathway on the kstR2-regulon. The "padR-regulon" (or "C-19+regulon"), regulated transcriptionally by the PadR repressor (MSMEG_2868), encodes a set of enzymes that catalyze the A-B rings modification of C-19 steroids and is localized in a genomic region called the C-19+ cluster. • Homologous C-19+ clusters have been annotated in different actinobacteria species (e. g., R. jostii RHA1, G. neofelifaecis NRRL B-59395, N. simplex VKM Ac-2033D), but remarkably they are absent in pathogenic actinobacteria such as M. tuberculosis. The C-19+ cluster are also not present in the industrial mycobacterial strains M. neoaurum VKM Ac-1815D and Mycobacterium sp. NRRL B-3805. • M. smegmatis has been shown to be a microbial cell factory suitable for the production of steroid compounds of interest (e. g, 9OH-AD, testosterone) from natural sterols by Metabolic Engineering approaches. • It has been demonstrated the importance of properly selecting enzymes KstD and KSH to optimize industrial biotechnological processes that present Δ1,2-dehydrogenation and 9α-hydroxylation reactions of 3-keto-steroids. 4. References:Donova, M. V. y Egorova, O. V. (2012). Microbial steroid transformations: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol 94: 1423-47. García, J. L., Uhía, I. y Galán, B. (2012). Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria. Microb Biotechnol 5: 679-99. Lednicer, D. (2011). Steroid chemistry at a glance. Wiley, Chichester. Nelson, D. L. y Cox, M. M. (2012). Lehninger principles of biochemistry. 6th edition. New York, WH Freeman.

[ES] 1. Introducción: Los compuestos de naturaleza esteroídica constituyen una familia de moléculas de gran relevancia biológica por su abundancia en la naturaleza y su participación en un amplio abanico de funciones celulares y fisiológicas en distintos organismos (Lednicer, 2011; Nelson y Cox, 2012). Desde mediados del siglo XX, se ha incrementado enormemente el número de moléculas esteroideas debido a la síntesis química de un gran número de compuestos xenobióticos con diferentes propiedades farmacológicas. El estudio de las rutas microbianas de degradación de esteroides ha despertado un gran interés en la comunidad científica en las últimas décadas, impulsado por por la abundancia de esteroides naturales y el aumento considerable de contaminantes xenobióticos esteroideos en el medio ambiente (García et al., 2012). Un número considerable de estos estudios se han realizado con Actinobacterias (Actinomicetos) y en particular, con representantes del suborden Corynebacterineae tales como Mycobacterium, Rhodococcus y Gordonia. Estos géneros incluyen bacterias patógenas como por ejemplo Mycobacterium tuberculosis o Rhodococcus equi, y bacterias o saprófitas o patógenas no-estrictas como por ejemplo Mycobacterium smegmatis, Gordonia neofelifaecis y Rhodococcus jostii. Los avances más importantes en este campo se han logrado en el estudio del catabolismo del colesterol, debido en gran medida al papel de esta molécula en la patogénesis de M. tuberculosis. Sin embargo, las actinobacterias normalmente contienen varios clusters génicos implicados en el catabolismo de esteroides, que les confieren la capacidad de mineralizar un amplio rango de esteroides (p. ej., esteroles, ácidos biliares, testosterona, progesterona). La complejidad de las moléculas esteroideas y por consiguiente de sus procesos de degradación, hace que el estudio de estas rutas sea especialmente difícil. Por otro lado, en la industria farmacéutica se han utilizado desde hace décadas biocatalizadores microbianos para facilitar la síntesis de nuevas moléculas esteroideas (Donova y Egorova, 2012). Para este propósito, tradicionalmente se han utilizado en procesos de biotransformación distintos microorganismos aislados del medio ambiente mejorados mediante técnicas convencionales de mutación al azar y selección. Sin embargo, recientemente se ha comenzado a explorar la implementación de aproximaciones de Ingeniería Metabólica y Biología Sintética para el desarrollo de biocatalizadores mejorados a la carta. De esta manera, en los últimos años se ha producido una convergencia de intereses entre el estudio de las rutas de catabolismo de esteroides y el diseño de biocatalizadores a la carta con fines industriales. Esta Tesis Doctoral se encuadra dentro de esta nueva aproximación experimental.

2. Objetivos y resultados: Al inicio de esta Tesis Doctoral, se propusieron dos objetivos fundamentales: 1. Investigar el catabolismo de esteroides en la bacteria M. smegmatis, que ha sido propuesta como modelo metabólico para el estudio del catabolismo del colesterol en actinobacterias. 2. Investigar el potencial de M. smegmatis como biofactoría celular para la producción de esteroides de interés industrial. En relación al primer objetivo de esta Tesis Doctoral, se ha estudiado en M. smegmatis la mineralización de los esteroides C-19 androst-4-en-3,17-diona (AD), androst-1,4-dien-3,17-diona (ADD) y 9α-hidroxi-4-androsten-3,17-diona (9OH-AD), que han sido postulados como intermediarios del catabolismo del colesterol. En contra de lo que cabría esperar, se ha observado que esta bacteria no puede utilizar los compuestos C-19 como única fuente de energía y carbono. Sólo el mutante ΔkstR, que expresa constitutivamente los genes del catabolismo del colesterol regulados por el represor KstR, metaboliza el AD y el ADD con ciertas dificultades, pero no el 9OH-AD, sugiriendo que estos compuestos no son verdaderos intermedarios de la ruta del colesterol. A partir de estos estudios se identificaron diferentes mutantes de M. smegmatis en el gen MSMEG_2868, que codifica un regulador tipo PadR, que metabolizan eficientemente todos los esteroides C-19. Estos mutantes en PadR expresan constitutivamente un grupo de genes denominado cluster C-19+ (MSMEG_2851 a MSMEG_2901), que codifica distintas enzimas metabolizadoras de esteroides que permanecen esencialmente inactivas bajo condiciones de cultivo convencionales. Estos genes son los responsables de la metabolización de esteroides C-19 en los mutantes en PadR. El cluster C-19+ aparentemente ha evolucionado independientemente del regulón kstR del colesterol, pero ambos convergen en el regulón kstR2 responsable del metabolismo de los anillos C y D de los esteroides. Se han identificado clusters C-19+ homólogos en otras actinobacterias que metabolizan esteroides, pero notablemente este cluster está ausente en M. tuberculosis. La identificación de este nuevo cluster génico ha permitido el descubrimiento de nuevas actividades enzimáticas de interés industrial (p. ej., 3-cetoesteroide-Δ1-deshidrogenasa, KstD; 3-cetoesteroide-9α-hidroxilasa, Ksh) y ha abierto la puerta al diseño de biocatalizadores celulares más robustos para la producción de esteroides. En relación al segundo objetivo, se ha estudiado la aplicación de los conocimientos anteriores para utilizar M. smegmatis como biofactoría celular en la producción de esteroides. Para ello, se ha investigado el uso de esta bacteria modelo en tres procesos de relevancia industrial: (i) producción de 9α- hidroxi-4-androsten-3,17-diona a partir de esteroles, (ii) producción de testosterona, (iii) Δ1,2- deshidrogenación y 9α-hidroxilación de 3-cetoesteroides. Los resultados obtenidos han aportado las pruebas de concepto que apoyan la utilización de M. smegmatis como un biocatalizador ideal para la implementación de metodologías de Ingeniería Metabólica y Biología Sintética en el desarrollo de bioprocesos industriales para la producción de esteroides a la carta.

3. Conclusiones: • Es necesario reformular el catabolismo de esteroles en actinobacterias y en particular, en M. smegmatis. Los resultados apoyan la hipótesis de que la degradación de la cadena lateral de los esteroides y las modificaciones químicas introducidas en los anillos A/B del núcleo esteroideo ocurren simultáneamente durante el catabólismo de esteroles y por tanto, los compuestos AD, ADD o 9OH-AD no son verdaderos intermediarios de estas rutas. • Se ha identificado una nueva ruta catabólica denominada ruta C-19+ involucrada en el catabolismo de esteroides C-19 en M. smegmatis, que converge con la ruta catabólica de esteroles a nivel del regulón kstR2. El “regulón padR” (o “regulón C-19+”), regulado transcripcionalmente por el represor PadR (MSMEG_2868), codifica un conjunto de enzimas que catalizan la modificación de los anillos A/B de los esteroides C-19 y se localiza en una región genómica denominada cluster C-19+. • Se han anotado clusters C-19+ homólogos en distintas especies de actinobacterias (p. ej., R. jostii RHA1, G. neofelifaecis NRRL B-59395, N. simplex VKM Ac-2033D), pero excepcionalmente están ausentes en algunas actinobacterias patógenas como por ejemplo M. tuberculosis. El cluster C-19+ tampoco está presente en las cepas industriales M. neoaurum VKM Ac-1815D y Mycobacterium sp. NRRL B-3805. • Se ha demostrado que la bacteria M. smegmatis es una biofactoría celular adecuada para la producción de compuestos esteroideos de interés (p. ej., 9OH-AD, testosterona) a partir de esteroles naturales mediante aproximaciones de Ingeniería Metabólica. • Se ha demostrado la importancia de seleccionar adecuadamente las enzimas KstD y KSH para optimizar procesos biotecnológicos industriales que incluyen reacciones de Δ1,2-deshidrogenación y 9α-hidroxilación de 3-cetoesteroides. 4. Referencias Donova, M. V. y Egorova, O. V. (2012). Microbial steroid transformations: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol 94: 1423-47. García, J. L., Uhía, I. y Galán, B. (2012). Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria. Microb Biotechnol 5: 679-99. Lednicer, D. (2011). Steroid chemistry at a glance. Wiley, Chichester. Nelson, D. L. y Cox, M. M. (2012). Lehninger principles of biochemistry. 6th edition. New York, WH Freeman.