Etude de la diversité phénotypique, génotypique et aptitudes technologiques des souches de Leuconostoc isolées localement

Abstract

[EN] The phenotypic and genotypic identification of twenty-eight strains isolated from six ecosystems (camel, goat and sheep milks, blue cheese, silage and honey) showed that they belong to the species Leuconostoc mesenteroides, seventeen of them belong to the subspecies. mesenteroides. Most of these strains showed significant proteolytic, lipolytic and acidifying activities, in addition to their ability to metabolize citrate. This last property was assessed by PCR detection of the citP gene, which encodes the citrate permease P, protein indispensable for citrate transport and consequently further metabolism of this compound. Electrophoretic analysis of the total proteins of L. mesenteroides strains from the different ecosystems showed a similarity with a homology ranging from 85% to 100%. The analysis of exopolysaccharides (EPS) production, in the presence of 2% sucrose, revealed variable levels (from 0.55 + 0.17 g L-1 to 3.52 + 0.18 g L-1). Taking into account these production rates and other technological properties, the three strains of L. mesenteroides (CM9, CM30 and SM34), isolated from algerian mammalian milks, were selected to produce and purify their EPS from bacterial culture supernatants by ethanol precipitation and by dialysis. In addition, their subsequent freezedrying allowed them to be maintained at room temperature for subsequent use in suspension. These polymers were compared with those produced by L. mesenteroides RTF10 and Lactobacillus sakei MN1 isolated from spanish meat products. Methylation analysis and determination of the composition of monomers revealed that the EPS are dextran-type homopolysaccharides with a main chain of α-(1,6) and partially branched glucopyranose units in the O-3 position by a single α-glucopyranose unit with a percentage which ranged from 8.5% to 10.3%. Exclusion chromatography combined with multiangle laser light scattering analysis demonstrated that the dextrans had molecular masses between 1.74 × 108 Da and 4.41 × 108 Da. Rheological analysis of the aqueous solutions of the polymer revealed that all EPS had pseudoplastic behavior under shear conditions and a random and flexible coil structure. Under shearing conditions, dextrans showed differences in viscosity, which increased as the concentration augmented. The metabolic study of five dextran-producing strains as well as the non-productive strain L. mesenteroides CM70, in the presence of sucrose as the sole carbón source, showed a correlation between main substrate consumption and dextran synthesis for the producers, and a difference in the levels of the intermediate (fructose and glucose) and final metabolites (lactic acid and mannitol) in all strains, according to their metabolic pathways In addition, the dextrans, purified by exclusion chromatography, could immunomodulate, in vitro, the human macrophages PMA-THP-1, counteracting partially the inflammatory effect of the Escherichia coli O111: B4 lipopolysaccharide. This test was carried out after the evaluation of the cytotoxicity of the EPS, which indicated no toxic effect of the dextrans on the metabolic activity of the THP-1 cell line. PCR detection and sequencing of the amplified DNA fragments indicated that all strains possess a dsr gene encoding a dextransucrase enzyme, responsible for the EPS production. During prolonged incubation on a sucrose-containing solid medium, the dextran-producing bacteria had two distinct phenotypes unrelated to the genus or the species to which they belonged. L. mesenteroides CM9 and Lb. sakei MN1 formed compact and mucoid colonies, while the colonies of the other three strains of Leuconostoc became diffuse after 72 h.

This differential behavior was also observed in the ability of the corresponding strains to bind to Caco-2 cells. The strains forming compact and mucoid colonies showed a high level of adhesion when cultured in the presence of glucose. On the other hand, it decreased in the presence of sucrose (a condition required for the synthesis of dextran). However, no influence of the carbon source was detected for the adhesion capacity of the other strains of L. mesenteroides, which showed variable levels of enterocyte binding. L. mesenteroides CM30, CM70 and in particular CM9 strains showed probiotic properties due to their ability to withstand the conditions of stress of the gastrointestinal tract, their antibiogram profiles and their antimicrobial activities against Staphylococcus aureus ATCC 25923 and E. coli ATCC 25922. In addition, L. mesenteroides CM9 showed, in vivo, the best pattern of intestine colonization of gnotobiotic zebrafish larvae. Keywords: lactic bacteria, Leuconostoc mesenteroides, bacterial typing, technological properties, exopolysaccharides, dextran, rheological properties, immunomodulation, adhesion, probiotic, zebrafish.

[FR] L’identification phénotypique et génotypique des vingt-huit souches isolées des six écosystèmes (lait de chamelle, lait de chèvre, lait de brebis, formage bleu, ensilage et miel) ont montré qu’elles appartiennent á l’espèce Leuconostoc mesenteroides dont dix-sept entre elles appartiennent á la sous-espèce mesenteroides. La plupart de ces souches ont montré une activité protéolytique, lipolytique et acidifiante importante, en plus de leur capacité à métaboliser le citrate dont la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a montré leur possession du géne citP codant pour la citrate perméase P, et par conséquent, un métabolisme postérieur de ce composé. L’électrophorèse des protéines totales des souches de L. mesenteroides représentatives des différents écosystèmes a montré la ressemblance des profils protéiques avec un taux de similitude variant entre 85% et 100%. L’étude de la production des exopolysaccharides (EPS), en présence de 2% de saccharose, a révélé des niveaux de production variables (entre 0,55 + 0,17 g L-1 et 3,52 + 0,18 g L-1). Selon ces taux de production et autres propriétés technologiques, les trois souches de L. mesenteroides (CM9, CM30 et SM34), isolées à partir de laits de mammifères algériens, ont été sélectionnées pour produire et purifier leurs EPS à partir de surnageants de culture bactérienne par précipitation à l'éthanol et par une dialyse postérieure. En plus, leur lyophilisation ultérieure a permis de les maintenir à une température ambiante pour une utilisation subséquente en suspension. Ces EPS ont été comparés avec ceux produits par les souches de L. mesenteroides RTF10 et de Lactobacillus sakei MN1, isolées des produits carnés espagnols. L'analyse de la méthylation et la détermination de la composition des monomères des EPS ont révélé que les EPS sont des homopolysaccharides de type dextranes avec une chaîne principale d'unités de glucopyranose liées par des liaisons α-(1,6) et partiellement ramifiés dans la position O-3 par une seule unité α-glucopyranose avec un pourcentage qui varie entre 8,5 % et 10,3%. La chromatographie d'exclusion associée à une analyse de détection de diffusion de lumière laser multiangle a démontré que les dextranes ont des masses moléculaires comprises entre 1,74 × 108 Da et 4,41 × 108 Da. L'analyse rhéologique des solutions aqueuses du polymère a révélé que tous avaient un comportement pseudoplastique dans des conditions de cisaillement et une structure de bobine aléatoire et flexible.

Les dextranes ont montré, sous cisaillement, une différence de viscosité, qui accroissait à mesure que la concentration augmentait. L'étude métabolique, en présence de saccharose en tant que seule source de carbone, des cinq souches productrices des dextranes ainsi que la souche, non productrice, L. mesenteroides CM70 a montré une corrélation entre la consommation de substrat principal et la synthèse des dextranes dans les souches productrices des EPS, ainsi qu'une différence dans le profil de production de leurs métabolites intermédiaires (fructose et glucose) et finaux (l'acide lactique et le mannitol) chez toutes les souches, selon leurs voies métaboliques. En outre, les dextranes, purifiés par chromatographie d’exclusion, étaient capables de immunomoduler des macrophages humains PMA-THP-1, in vitro, neutralisant partiellement l'effet inflammatoire du lipopolysaccharide d’Escherichia coli O111:B4. Ce test a été réalisé après l’évaluation de la cytotoxicité des polymères mises en test, qui n’a indiqué aucun effet toxique sur l’activité métabolique des monocytes différenciées de la lignée cellulaire THP-1. La détection par PCR et le séquençage du fragment amplifié ont indiqué que toutes les souches isolées possèdent le gène dsr codant pour l’enzyme dextranesaccharase, responsable de la production de dextrane. Pendant une incubation prolongée sur un milieu solide contenant du saccharose, les bactéries productrices de dextrane présentaient deux phénotypes distincts non liés au genre ou aux espèces auxquels elles appartenaient. Les souches de L. mesenteroides CM9 et Lb. sakei MN1 ont formé des colonies mucoïdes et compactes, alors que les colonies des trois autres souches de Leuconostoc sont devenues diffuses après 72 h d’incubation. Ce comportement différentiel a également été observé dans la capacité des souches correspondantes à se lier aux cellules Caco-2. Les souches formant des colonies mucoïdes compactes ont montré un niveau élevé d'adhésion lorsqu'elles ont été cultivées en présence de glucose, par contre, il a diminué en présence de saccharose (condition requise pour la synthèse du dextrane). Cependant, aucune influence de la source de carbone n'a été détectée pour la capacité d'adhésion pour les autres souches de L. mesenteroides, qui ont montré des niveaux variables de liaison aux entérocytes. Les souches de L. mesenteroides CM30, CM70 et en particulier CM9 ont présenté des propriétés probiotiques vu leurs capacités á résister aux conditions de stress du tractus gastro-intestinal, leurs profils d’antibiogramme et leurs activités antimicrobiennes contre S. aureus ATCC 25923 et E. coli ATCC 25922. En outre, L. mesenteroides CM9 a montré le meilleur profil de colonisation, in vivo, de l’intestin des larves gnotobiotiques de poisson zèbre. Mots clés : bactéries lactiques, Leuconostoc mesenteroides, typification bactérienne, propriétés technologiques, exopolysaccharides, dextrane, propriétés rhéologiques, immunomodulation, adhésion, probiotique, poisson zèbre.

[ES] La identificación fenotípica y genotípica de ventiocho cepas aisladas de seis ecosistemas (leche de camella, leche de cabra, leche de oveja, queso azul, ensilado y miel) mostraron que pertenecen a la especie Leuconostoc mesenteroides y que diecisiete de ellas pertenecen a la subespecie mesenteroides. La mayoría de estas cepas mostraron una actividad proteolítica, lipolítica y acidificante significativa, además de su capacidad para metabolizar el citrato. Esta última característica fue correlacionada con la detección por PCR del gen citP que codifica la citrato permeasa P, proteína indispensable para el transporte del citrato al citoplasma yn consecuentemente para su posterior metabolización. La electroforesis de las proteínas totales de las cepas de L. mesenteroides representativas de los diferentes ecosistemas mostró la similitud de los perfiles proteicos con un porcentaje de homología que varió entre el 85% y el 100%. El estudio de la producción de exopolisacáridos (EPS), en presencia de sacarosa al 2%, reveló niveles de producción variables (entre 0,55 + 0,17 g L-1 y 3,52 + 0,18 g L-1). Teniendo en cuenta la eficiencia de producción de los EPS y otros factores tecnológicos, se seleccionaron tres cepas de L. mesenteroides (CM9, CM30 y SM34), aisladas a partir de leches de mamíferos argelinos, para producir y purificar sus EPS a partir de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos mediante precipitación con etanol y posterior diálisis. Además, su posterior liofilización permitió mantenerlos a temperatura ambiente para su ulterior utilización por suspensión. Estos EPS se compararon con los producidos por las cepas de L. mesenteroides RTF10 y Lactobacillus sakei MN1 aisladas de productos cárnicos españoles.

El análisis de la metilación y la determinación de la composición de los monómeros reveló que los EPS son homopolisacáridos del tipo dextrano con una cadena principal de unidades de glucopiranosa α- (1,6) y parcialmente ramificadas en la posición O-3 por una única unidad de α-glucopiranosa con un porcentaje que varíaba entre el 8,5% y el 10,3%. Cromatografía de exclusión combinada con un análisis de dispersión de luz láser multiangulo demostró que los dextranos tenían masas moleculares entre 1,74 x 108 Da y 4,41 x 108 Da. El análisis reológico de las soluciones acuosas de estos polímeros reveló que todas tenían comportamiento pseudoplástico bajo condiciones de cizalla y una estructura de espiral enrollada al azar y flexible. Los dextranos mostraron, bajo cizalla, una diferencia de viscosidad, que aumentó a medida que aumentaba la concentración. El estudio metabólico, en presencia de sacarosa como única fuente de carbono, de cinco cepas productoras de dextranos y la cepa no productora L. mesenteroides CM70 mostró una correlación entre el consumo de sacarosa, sustrato primario y la síntesis de los dextranos en las cepas productoras y una diferencia en el perfil de producción de los metabolitos intermedios (fructosa y glucosa) y finales (ácido láctico y manitol) en todas las cepas, dependiendo de sus rutas metabólicas. Además, los dextranos purificados por cromatografía de exclusión, fueron capaces de inmunomodular in vitro los macrófagos humanos PMA-THP-1, neutralizando parcialmente el efecto inflamatorio del lipopolisacárido de Escherichia coli O111: B4. Este ensayo se llevó a cabo después de la evaluación de la citotoxicidad de los polímeros estudiados, que no indicó ningún efecto tóxico sobre la actividad metabólica de las cellulas THP-1. La detección por PCR y la secuenciación de los fragmentos de DNA amplificados indicó que todas las cepas poseen un gen dsr que codifica una dextransacarasa, enzima responsable de la producción del EPS. Durante la incubación prolongada en un medio sólido que contiene sacarosa, las bacterias productoras del dextrano mostraron dos fenotipos distintos no relacionados con el género o la especie a la que pertenecían. Las cepas de L. mesenteroides CM9 y Lb. sakei MN1, formaron colonias mucosas y compactas, mientras que las colonias de las otras tres cepas de Leuconostoc se volvieron difusas después de 72 h de incubación. Este comportamiento diferencial también se observó en la capacidad de las cepas correspondientes para unirse a células Caco-2. Las cepas que formaban colonias mucosas y compactas mostraron un alto nivel de adhesión cuando se cultivaron en presencia de glucosa, que se redujo en presencia de sacarosa (condición requerida para la síntesis del dextrano). Sin embargo, no se detectó influencia de la fuente de carbono sobre la capacidad de adhesión de las otras cepas de L. mesenteroides, que mostraron niveles variables de unión a enterocitos. Las cepas CM30, CM70 y particularmente CM9 mostraron unos perfiles probióticos significativos teniendo en cuenta sus capacidades para resistir las condiciones de estrés del tracto gastrointestinal, sus perfiles de resistencia a antibióticos y sus actividades antimicrobianas contra Staphylococcus aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922. Además, L. mesenteroides CM9 fue la cepa que mostró, in vivo, el mejor patrón de colonización del intestino de larvas gnotobióticas del pez cebra. Palabras clave: bacterias lácticas, Leuconostoc mesenteroides, tipificación bacteriana, propiedades tecnológicas, exopolysacáridos, dextrano, propiedades reológicas, inmunomodulación, adhesión, probióticos, pez cebra.