Estudio de xilanasas fúngicas para el aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica

Abstract

[EN] Introduction Xylan represents the second carbon reservoir in the biosphere, only preceded by cellulose. It is a heteropolysaccharide belonging to the group of hemicelluloses, therefore it is a part of most of the main sources of lignocellulosic biomass. Structurally, it is composed of a backbone of β-1,4-linked D-xylopyranosyl units, which is frequently acetylated and highly branched by short side chains of arabinose or glucuronic acid. The abundance of each of these substituents depends largely on the nature of the plant biomass. Due to its complexity, xylan hydrolysis requires the concerted action of multiple enzymes, among which two types of glycosidases, endo-β-1,4-xylanases and β-xylosidases, play the major roles. The former hydrolyze the polysaccharide by attacking internal links in the main chain, releasing oligosaccharides with different polymerization degrees. β-Xylosidases end the process by converting these xylooligosaccharides (XOS) into xylose. The economical relevance of exploiting this heteropolysaccharide is based on its great abundance and has driven the research on both xylanolytic enzymes. Industry is interested both in xylan saccharification for obtaining biofuels, and in its conversion into high value-added products. Attending to the latter possibility, endoxylanases can be applied for producing XOS, which are currently considered emerging prebiotics. Regarding β-xylosidases, many of these glycosidases display the capacity of transferring a xylosyl residue to an acceptor compound, in a reaction called transxylosylation. By this way bioactive glycosides could be obtained, opening a new field for the application of these catalysts. The xylanolytic enzymes are produced in nature mainly by bacteria and fungi for degradation of plant cell wall polysaccharides. Among these organisms, filamentous fungi are the ones which have aroused the greatest interest as producers of these enzymes. The reasons are the higher levels of xylanolytic activities displayed by fungi and the frequent secretion of the desired enzymes to the extracellular medium, which facilitates both the purification and direct use of fungal crudes for several applications. Aims Talaromyces amestolkiae CIB, deposited at the IJFM (Instituto Jaime Ferrán de Microbiología) culture collection with the reference A795, is an ascomycete fungus isolated from cereal wastes and identified in the laboratory of Dr. María Jesús Martínez, in the Biological Research Center, where this doctoral thesis has been carried out. The cellulolytic system of this fungus had been previously characterized, displaying very interesting properties. For this reason, the studies on this organism continued with the analysis of the enzymes involved in xylan degradation. With this purpose, the following tasks were established:

a) Study of the production by T. amestolkiae of enzymes implicated in xylan degradation. b) Purification and characterization, from a biochemical and molecular perspective, of the main xylanolytic enzymes secreted by this fungus. c) Study of the potential biotechnological applications of these biocatalysts for the valorization of plant biomass. Results: Study of the production of xylanolytic enzymes by T. amestolkiae The levels of xylanolytic activity released by T. amestolkiae were assayed by culturing the fungus in liquid medium in the presence of different carbon sources. Among the potential inducers tested, beechwood xylan at a concentration of 2% (w/v) led to the maximal secretion of both β-xylosidase and endoxylanase activities. These conditions were kept for production of the enzymes of interest across this work. Characterization of a novel β-xylosidase of biotechnological interest A novel β-xylosidase was purified and characterized from T. amestolkiae cultures. Further sequencing of its gene led to its classification into the glycosyl hydrolase family 3. The enzyme showed about 10% N-glycosylation and a dimeric quaternary structure. Its characterization revealed several properties of interest. At the physicochemical level, the 2+enzyme displayed a remarkable tolerance to the presence of Cu , which is a strong inhibitor of most of the known xylanolytic and cellulolytic enzymes. Its maximal activity occurred at highly acidic values (pH 3), although it displayed high stability in a wide pH range (2-9). In terms of kinetics, it is particularly remarkable that the enzyme showed the greatest values of catalytic efficiency reported for a β-xylosidase against natural XOS from 3 to 6 units. Studies using alkan-ols revealed that, as described for other GH3 glycosidases, BxTW1 demonstrated the capacity of catalyzing transxylosylation reactions. An in-depth analysis extended its potential acceptor range to sugar alcohols, monosaccharides and disaccharides. In addition to this versatility, it was established that transxylosylation yields were high and the process took place in a regioselective way. Its acceptor promiscuity, regioselectivity and physico-chemical and kinetic properties suggest that BxTW1 may be a biotechnologically interesting tool. Heterologous expression of BxTW1 and synthesis of a xyloside with antitumor properties With the purpose of improving the yields of β-xylosidase obtained from the cultures of T. amestolkiae, the gene bxtw1 was expressed in the yeast Pichia pastoris. The recombinant strain secreted rBxTW1 levels surpassing by 10-fold those released by the native producer.

In addition, enzyme purification became much simpler and was accomplished in a single chromatographic step. The availability of high quantities of purified enzyme allowed progressing on the characterization of the transxylosylation potential of rBxTW1 using a compound library containing potential acceptors with very different natures. The result of the assay showed that this glycosidase can use several aromatic derivatives, including naphthols, as acceptors. This led to the synthesis of 2-(6-hydroxinaphtyl) β-D-xylopyranoside, a compound reported as selective antiproliferative, from 2,6-dihydroxynaphtalene and xylobiose. The optimization of the process by applying the Box-Behnken design, a response surface methodology (RSM), increased the production of the xyloside about 8-fold when compared to the initial conditions. Synthesis of a xylosyl derivative from hydroxytyrosol with neuroprotective properties The capacity of rBxTW1 for xylosylating several aromatic compounds led to the search of novel transxylosylation acceptors of possible industrial interest. In this case, some plant phenolic antioxidants were selected attending to the existing interest in obtaining their glycosyl derivatives. Among the tested acceptors, xylosides from catechol, hydroquinone and hydroxytyrosol were obtained, being the latter especially interesting due both to its novelty and high transxylosylation yield. Hydroxytyrosol is the most potent antioxidant in olive oil and the in-depth study of its enzymatic glycosylation demonstrated the regioselective synthesis of the xyloside 3,4-dihidroxyphenyl-ethyl-O-β-D-xylopyranoside, The production levels achieved were the highest reported up to date for the enzymatic synthesis of glycosyl derivatives from this antioxidant. In vitro assays using cell cultures demonstrated that the novel compound displayed similar anti-inflammatory properties as the aglycon, but its neuroprotective capacity was remarkably superior in the assayed conditions. Enzymatic production of xylooligosaccharides by an endoxylanase from T. amestolkiae A novel endoxylanase was purified and characterized from the crudes of T. amestolkiae. At the biochemical level, the purified enzyme (XynM) displayed high selectivity and low molecular mass (~20 kDa), which are properties typically associated with the GH11 family. The activity profiles related to temperature and pH were similar to other reported xylanases from Penicillium and Talaromyces genera, although its 2+ 2+tolerance to Cu and Pb must be highlighted. Once characterized, this endoxylanase was applied to the production of XOS from birchwood xylan. The characterization of the oligosaccharide mixture obtained revealed the presence of both neutral and charged XOS, being xylobiose, xylotriose and xylotetraose the main products. In addition, the negligible content of xylose in the mixture is remarkably positive, given the fact that this monosaccharide has no nutraceutic value. Finally, its prebiotic potential was evaluated by fermentation of feces from a breast-fed child, determining the profile of organic acids in the cultures and the bacterial microbiome developed. Both assays confirmed the prebiotic properties of these XOS, which demonstrated bifidogenic capacity, outstanding also for strongly promoting the growth of Staphylococcus hominis, an organism considered as a potential prebiotic in recent studies.

Conclusions The studies developed in this doctoral thesis have led to the isolation and characterization of two xylanolytic enzymes that can be applied to the obtention of added-value products from xylan. The β-xylosidase displayed a wide range of potential transxylosylation acceptors together with high reaction yields and regioselectivity. The exploitation of these features allowed the enzymatic synthesis of two xylosides, whose bioactive properties have been demonstrated: 2-(6-hydroxynaphtyl) β-D-xylopyranoside, a selective antiproliferative agent, and the neuroprotective antioxidant 3,4-dihidroxiphenyl-ethyl-O-β-D-xylopyranoside. Regarding the endoxylanase, it was characterized and subsequently used for obtaining a xylooligosaccharides mixture from birchwood xylan, with remarkable prebiotic capacities. This work opens new possibilities for the enzymatic production of xylosides and xylan derivatives of interest, and highlights the role of filamentous fungi as valuable sources of enzymes for lignocellulosic biomass valorization.

[ES] Introducción El xilano constituye la segunda mayor reserva de carbono de la biosfera, sólo precedido por la celulosa. Es un heteropolisacárido perteneciente al grupo de las hemicelulosas por lo que está presente en la mayoría de las principales fuentes de biomasa lignocelulósica. Estructuralmente, estos polímeros se caracterizan por tener una cadena principal de unidades de D-xilopiranosa unidas por enlaces β-1,4. Este esqueleto presenta frecuentes acetilaciones y está altamente ramificado, con cadenas laterales muy cortas, formadas por residuos de arabinosa o ácido glucurónico. La abundancia de cada uno de los sustituyentes depende, en gran medida, del tipo de biomasa vegetal. Debido a esta complejidad su hidrólisis necesita de la acción concertada de toda una batería de enzimas, de entre las cuales las endoxilanasas y las β-xilosidasas desempeñan un papel esencial. Las primeras hidrolizan el polisacárido atacando enlaces internos de la cadena principal, liberando como productos oligosacáridos con distinto grado de polimerización. Las β-xilosidasas son enzimas que completan la degradación, convirtiendo estos xilooligosacáridos (XOS) en xilosa. La importancia económica del aprovechamiento de este heteropolisacárido nace fundamentalmente de su gran abundancia y ha supuesto un fuerte impulso para la investigación sobre ambas enzimas xilanolíticas. La industria busca tanto la sacarificación del xilano, con vistas a la obtención de biocombustibles, como su conversión en productos de alto valor añadido. En este último campo, las endoxilanasas pueden aplicarse para la obtención de XOS, considerados actualmente prebióticos emergentes. En cuanto a las β-xilosidasas, aunque su papel más conocido es el hidrolítico, muchas presentan también la capacidad de transferir un residuo de xilosa a un compuesto aceptor, en una reacción denominada transxilosilación. De esta forma se podrían obtener glicósidos con propiedades bioactivas, abriendo un nuevo campo para la aplicación de estas enzimas. Las enzimas xilanolíticas son producidas en la naturaleza principalmente por bacterias y hongos, con el fin de degradar los polisacáridos de la pared celular vegetal. De entre estos organismos, son los hongos filamentosos los que han despertado un mayor interés como productores de estas enzimas en los últimos años. Esto es debido a que muestran mayores niveles de actividad frente a xilano y frecuentemente secretan las enzimas de interés al medio extracelular, lo que facilita tanto su urificación como el uso directo de los crudos fúngicos en diferentes aplicaciones. Objetivos Talaromyces amestolkiae CIB, depositado en la colección de cultivosIJFM (Instituto Jaime Ferrán de Microbiología) bajo la referencia A795, es un hongo ascomiceto aislado de residuos de cereales, e identificado en el laboratorio de la Dra. María Jesús Martínez en el Centro de Investigaciones Biológicas, donde se ha realizado la presente tesis doctoral. El sistema celulolítico de este hongo había sido caracterizado previamente mostrando propiedades de gran interés. Por este motivo se continuaron los estudios sobre este organismo abordando el análisis de las enzimas implicadas en la degradación del xilano. Para ello se definieron los siguientes objetivos: a) Estudio de la producción por T. amestolkiae de enzimas implicadas en la degradación del xilano.

b) Purificación y caracterización, desde un punto de vista bioquímico y molecular, de las principales enzimas xilanolíticas secretadas por este hongo. c) Estudio de las posibles aplicaciones biotecnológicas de estos biocatalizadores para la valorización de la biomasa vegetal. Resultados: Estudio de la producción de enzimas xilanolíticas por T. amestolkiae Los niveles de actividad xilanolítica secretados por T. amestolkiae se analizaron cultivando el hongo en medio líquido en presencia de distintas fuentes de carbono. De entre los potenciales inductores probados, el xilano de haya, a una concentración del 2% (p/v), fue el que produjo la máxima secreción tanto de actividad β-xilosidasa como endoxilanasa. Estas ondiciones fueron mantenidas en el resto del trabajo para la producción de las enzimas de interés. Caracterización de una nueva β-xilosidasa de interés biotecnológico. A partir de los cultivos de T. amestolkiae, se purificó y caracterizó una nueva β-xilosidasa. La posterior secuenciación de su gen permitió clasificarla como perteneciente a la familia 3 de las glicosil hidrolasas. La enzima (BxTW1) presentó un grado de N-glicosilación en torno al 10% y una estructura cuaternaria dimérica. Su caracterización reveló varias propiedades de interés. A nivel físico-químico la enzima demostró una 2+notable tolerancia a la presencia del catión Cu , potente inhibidor de la mayoría de enzimas xilanolíticas y celulolíticas. Su máxima actividad se encontró a valores de alta acidez (pH 3), aunque su estabilidad fue alta en un amplio rango de pH (2-9). Desde el punto de vista cinético, la enzima destacó por presentar los mayores valores de eficacia catalítica descritos para una β-xilosidasa frente a XOS naturales de 3 a 6 unidades. Los estudios con alcoholes de alcanos revelaron que, como otras glicosidasas de la familia GH3, BxTW1 mostraba la capacidad de catalizar reacciones de transxilosilación. Un análisis más detallado amplió el rango de posibles aceptores de la enzima a alcoholes de azúcar, monosacáridos y disacáridos. Además de esta versatilidad, se comprobó que los rendimientos de la transxilosilación eran altos y que, además, el proceso tenía lugar de forma regioselectiva. La promiscuidad de aceptor, junto con la regioselectividad y sus propiedades fisico-químicas y cinéticas, sugerían que BxTW1 podía ser una herramienta biotecnológica de interés. Expresión heteróloga de BxTW1 y síntesis de un xilósido con propiedades antitumorales Con el fin de mejorar los rendimientos en la obtención de la β-xilosidasa de T. amestolkiae a partir de los cultivos fúngicos, se expresó el gen bxtw1 en la levadura Pichia pastoris. La cepa recombinante secretó niveles de rBxTW1 10 veces mayores que los del hongo y su purificación resultó ser mucho más sencilla, ya que se consiguó obtener enzima pura tras un único paso cromatográfico. La disponibilidad de altas cantidades de enzima pura permitió continuar con la caracterización del potencial de transxilosilación de rBxTW1, evaluando una librería de potenciales aceptores de muy distinta naturaleza.

El resultado del ensayo mostró queesta glicosidasa puede utilizar como aceptores diversos derivados aromáticos, como los naftoles. Esto llevó a la síntesis de 2-(6-hidroxinaftil) β-D-xilopiranósido, un compuesto descrito como antiproliferativo selectivo, a partir de 2,6-dihidroxinaftaleno y xilobiosa. La optimización del proceso aplicando un método de respuesta en superficie (el diseño Box-Behnken) aumentó unas 8 veces el rendimiento en la producción del xilósido respecto a las condiciones iniciales. Síntesis de un derivado xilosilado de hidroxitirosol con propiedades neuroprotectoras. La capacidad de rBxTW1 para xilosilar distintos compuestos aromáticos motivó la búsqueda de nuevos aceptores de transxilosilación con posible importancia industrial. En este caso se seleccionaron antioxidantes fenólicos de origen vegetal debido al interés existente en la obtención de sus derivados glicosilados. De entre los aceptores ensayados, se obtuvieron xilósidos de catecol, hidroquinona e hidroxitirosol, siendo este último el que despertó mayor interés, tanto por su novedad como por el alto rendimiento obtenido en su transxilosilación. El hidroxitirosol es el antioxidante más potente presente en el aceite de oliva y el estudio detallado de su glicosilación demostró la síntesis regioselectiva del xilósido 3,4-dihidroxifenil-etil-O-β-D-xilopiranósido. Los niveles de producción alcanzados fueron los más altos descritos hasta la fecha para la obtención enzimática de cualquier derivado glicosilado de este antioxidante. Mediante aproximaciones in vitro, utilizando cultivos celulares, se demostró que el nuevo compuesto mostraba propiedades antiinflamatorias similares a las del hidroxitirosol, pero su capacidad neuroprotectora era muy superior, en las condiciones en las que se realizaron estos ensayos. Utilización de una endoxilanasa de T. amestolkiae para la producción enzimática de xilooligosacáridos. Se purificó y caracterizó una nueva endoxilanasa de los cultivos de T. amestolkiae. A nivel bioquímico, la enzima purificada (XynM) mostró alta selectividad y una masa molecular pequeña (~20 kDa), propiedades típicamente asociadas a la familia GH11. Los perfiles de actividad en relación a pH y temperatura son similares a los de otras xilanasas descritas de los géneros Penicillium y Talaromyces, aunque la enzima destaca por su 2+ 2+tolerancia al Cu y al Pb . Una vez caracterizada, esta endoxilanasa fue utilizada para la producción de XOS a partir de xilano de abedul. La caracterización de la mezcla oligosacarídica obtenida reveló la presencia tanto de XOS neutros como cargados, siendo xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa los productos mayoritarios. Por otra parte, la mezcla destacó por su contenido despreciable en xilosa, un monosacárido sin valor nutracéutico. Finalmente, su potencial prebiótico fue evaluado mediante la fermentación de heces de bebé lactante, analizándose el perfil de ácidos orgánicos en los cultivos y el microbioma bacteriano resultante. Ambos ensayos confirmaron el carácter prebiótico de estos XOS, que poseían capacidades bifidogénicas y destacaron por promover fuertemente el crecimiento de Staphylococcus hominis, un organismo considerado en estudios recientes como potencial probiótico.

Conclusiones: Como resultado de los estudios llevados a cabo en la presente tesis doctoral se han aislado y caracterizado dos enzimas xilanolíticas que pueden ser aplicadas en la obtención de productos de valor añadido a partir del xilano. La β-xilosidasa mostró un amplio rango de posibles aceptores de transxilosilación, acompañado de altos rendimientos y regioselectividad. El aprovechamiento de estas características permitió la síntesis enzimática de dos xilósidos con propiedades bioactivas: el agente antiproliferativo selectivo 2-(6-hidroxinaftil) β-D-xilopiranósido y el antioxidante neuroprotector 3,4-dihidroxifenil-etil-O-β-Dxilopiranósido. Respecto a la endoxilanasa, tras su caracterización se ha demostrado que puede ser utilizada para la obtención de una mezcla de xilooligosacáridos, a partir de xilano de abedul, con notables capacidades prebióticas. Este trabajo abre nuevas posibilidades para la obtención de xilósidos y derivados de xilano de interés y pone de relieve el papel de los hongos filamentosos como xcelentes fuentes de enzimas para la valorización de la biomasa lignocelulósica.