Reconocimiento molecular basado en técnicas de RMN

Abstract

[EN] Molecular recognition is at heart of life processes relevant to health and disease. Deciphering the code of the intermolecular communication at structural level is enormous interest for the understanding of many biological events. Among the variety of techniques applied in this field, NMR may provide valuable information, at different levels, on the formed bio-complexes. NMR has been continuously exploited to reach unexpected limits a few years ago. In this thesis, different NMR techniques, methods and protocols have been extensively applied to study a variety molecular recognition processes at diverse levels of complexity. In particular, these applications of NMR have permitted gathering information on the molecular recognition features of these events, from the ligand and/or receptor perspectives. Special emphasis has been paid to unravel interaction phenomena where carbohydrates are involved. In a parallel manner, analogous NMR methods have also been used in the field of protein dynamics as well as for screening ligand mixtures through a NMR-guided dynamic combinatorial chemistry approach. Introduction The initial section of this thesis outlines the basic concepts for applying NMR methods to study molecular recognition events and describes the biochemical background of the employed systems. The NMR-based ligand and receptor perspectives are presented as alternatives to gain access to complementary information of the ligand-receptor interaction. The ligand-point-of-view NMR experiments, focused on the observation of the ligand NMR signals, reveal key information on the interacting epitope and ligand conformation. The most relevant NMR experiments within this class (STD-NMR) are based on the detection of simple saturation transfer phenomena for a system in chemical exchange (free to bound and viceversa). Conversely, the receptor point of view NMR experiments provide atomic level information on the receptor and permit to define more precisely key features of the recognition event (i.e. amino acids at the binding pocket). The NMR experiments from the receptor perspective, generally, involve the observation of receptor signals in heteronuclear NMR experiments before and after the addition of the ligand. n addition, we also introduce the intermolecular interactions important for molecular recognition and the biochemical players (i.e. carbohydrates, proteins, DNA) that are involved in the interacting process.

Introduction The initial section of this thesis outlines the basic concepts for applying NMR methods to study molecular recognition events and describes the biochemical background of the employed systems. The NMR-based ligand and receptor perspectives are presented as alternatives to gain access to complementary information of the ligand-receptor interaction. The ligand-point-of-view NMR experiments, focused on the observation of the ligand NMR signals, reveal key information on the interacting epitope and ligand conformation. The most relevant NMR experiments within this class (STD-NMR) are based on the detection of simple saturation transfer phenomena for a system in chemical exchange (free to bound and viceversa). Conversely, the receptor point of view NMR experiments provide atomic level information on the receptor and permit to define more precisely key features of the recognition event (i.e. amino acids at the binding pocket). The NMR experiments from the receptor perspective, generally, involve the observation of receptor signals in heteronuclear NMR experiments before and after the addition of the ligand. n addition, we also introduce the intermolecular interactions important for molecular recognition and the biochemical players (i.e. carbohydrates, proteins, DNA) that are involved in the interacting process.

General objective The general objective of the thesis is to apply ligand- and receptor-based NMR methods to study the interaction of a variety of ligands of diverse chemical nature with receptors of biological and/or biomedical interest. NMR applications to carbohydrate recognition This part is focused on gathering key information of carbohydrate recognition relevant for biomedical applications. During long time, carbohydrates were mainly considered as the source of energy for living organisms. It is evident today that carbohydrates play additional important roles in numerous life processes and also transmit important biological information. Carbohydrates located at the surface and cellular surroundings are involved in molecular recognition processes by establishing interactions with antibodies, proteins, viruses, cells, bacteria… which trigger a variety of intracellular and extracellular processes of special physiological and pathological interest. Herein, by applying NMR strategies that rely on ligand and/or receptor observation, we have studied different carbohydrate-based biological systems: i) The analysis of the recognition features of synthetic tryciclic Tn antigen mimetics revealed a similar binding mode as that of the Tn reference model (-OMeGalNAc) towards different lectins. ii) The bifunctional character of a synthetic branched glycan covalently connected to a protease inhibitor and its capacity for targeting simultaneously different proteins has been demonstrated. iii) The specificity of the interaction of monoclonal antibodies targeting the carbohydrate-based xenoantigen has been deduced by STD-NMR, also showing the existence of different affinities for the -gal xenoantigen and derivatives thereof to a series of antibodies. In particular, the anomeric specificity of the interaction of the N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) antigen towards different antibodies has also been shown. iv) The binding mode of the hemagglutinins (HA) from influenza virus strains towards the sialic acid epitopes present in N-glycans has also been elucidated by STD-NMR. The experimental data, combined with docking calculations, have revealed the existence of distinct binding modes, depending on the regiochemistry of the Neu5Ac linkage.

NMR applications to dynamic processes and other systems. Biological processes are inherently dynamic since proteins and ligands can sample a vast ensemble of conformations. The understanding of the intrinsic dynamic features of the system under study is of paramount importance to monitor, explain and modulate the associated binding events. In this context, NMR provides a diversity of experimental strategies based on relaxation parameters and/or dipolar interactions to get insights into the conformational behavior of ligands and receptors in their free and bound states. Moreover, NMR can also be applied in chemical dynamic systems, including the deconvolution of the interaction of dynamic combinatorial libraries with receptors, a process where multiple reversible reactions take place. In this chapter, we describe different examples of the application of NMR methods to the study of the structural, conformational and dynamics features of systems of diverse chemical nature and biological interest. In particular, i) NMR methods have been applied to study the degree of ordering of protein domains by the analysis of NMR dynamic parameters (R1, R2 and hetNOE) of a fragment of the CHOP transcription factor. ii) In a parallel manner, the NMR-based conformational analysis (tr-NOESY experiments) of a synthetic epothilone derivative bound to tubulin revealed the presence of a similar binding mode to that described for natural epothilone-A. iii) The interaction of a family of molecules with the DNA minor groove has been also characterized by other NMR methods, allowing to deduce their specificity towards the A/T rich regions as well as the structure of their complexes. iv) Finally, the application of NMR methods to the study of a dynamic combinatorial chemistry in the presence of a given protein target (Frequenin-2) has permitted the direct non-ambiguous identification of new binders.

[ES] El reconocimiento molecular está presente en numerosos procesos vitales y relevantes para la salud y la enfermedad. El conocimiento de la comunicación intermolecular a nivel estructural es de especial interés para el entendimiento de numerosos procesos biológicos. De entre la gran variedad de técnicas aplicadas al reconocimiento molecular, la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) proporciona información valiosa a diferentes niveles de los bio-complejos formados. Desde el comienzo, la RMN ha sido explotada hasta alcanzar límites insospechados. En esta tesis, diferentes técnicas, métodos y protocolos basados en RMN se han aplicado extensamente para estudiar una variedad de procesos de reconocimiento molecular de diferentes niveles de complejidad. En particular, esta aplicación de la RMN ha permitido recopilar información sobre las características del reconocimiento molecular de estos eventos abordado desde las perspectivas del ligando y/o receptor. Se ha hecho especial hincapié en desentrañar los fenómenos de interacción en los que intervienen los carbohidratos. De manera paralela, también se han utilizado métodos de RMN análogos en el campo de la dinámica de proteínas así como para cribar mezclas de ligandos mediante un enfoque de química dinámica combinatoria guiada por RMN. Introducción Este capítulo introduce las bases de la RMN aplicada al reconocimiento molecular y describe el fondo bioquímico de los sistemas biológicos estudiados. Las perspectivas de ligando y receptor basadas en RMN se presentan como alternativas para obtener acceso a información complementaria de la interacción ligando-receptor. Desde el punto de vista del ligando, los experimentos de RMN están enfocados en la observación de las señales del ligando revelando información clave sobre el epitopo de unión del ligando así como de su conformación en el estado unido. Los experimentos de RMN más relevantes dentro de esta clase (STD-NMR) se basan en la transferencia de saturación de la magnetización para un sistema en intercambio químico (del estado libre al unido y viceversa). Por otro lado, los experimentos de RMN desde el punto de vista del receptor, proporcionan información a nivel atómico valiosa sobre receptor y permiten definir con mayor precisión rasgos clave del evento de reconocimiento (ej. amino ácidos del sitio de unión). Estos últimos métodos, generalmente implican la observación de las señales del receptor en experimentos de correlación heteronuclear en ausencia y en presencia del ligando. También, se describen las principales interacciones intermoleculares esenciales para el reconocimiento molecular y se introducen los principales actores bioquímicos (proteínas, carbohidratos, ADN) involucrados en los procesos de reconocimiento.

Objetivos generales: El objetivo general de la tesis es la aplicación de métodos basados en RMN desde el punto vista del ligando y del receptor para el estudio de interacciones de ligandos de diversa naturaleza química con receptores de interés biológico y/o biomédico. Aplicaciones de la RMN al reconocimiento molecular de carbohidratos Este capítulo se encuentra enfocado a la obtención de información clave del reconocimiento de carbohidratos para aplicaciones biomédicas. Durante mucho tiempo, los carbohidratos fueron considerados como la principal fuente de energía de los seres vivos. Hoy en día, resulta evidente que los carbohidratos desempeñan un papel importante en numerosos procesos biológicos y que son capaces de transmitir ingente cantidad de información biológica importante. Los carbohidratos situados en la superficie de las células y su entorno se encuentran a menudo implicados en importantes procesos de reconocimiento molecular estableciendo interacciones con anticuerpos, proteínas, virus, células, bacterias… que desencadenar una variedad de procesos intra e inter celulares de interés fisiológico y patológico. En esta sección, mediante la aplicación de estrategias basadas en RMN tanto del punto vista del ligando como del receptor, se ha estudiado diferentes sistemas biológicos carbohidrato-receptor: i) El análisis de las características de reconocimiento de los miméticos sintéticos de antígeno Tn reveló un modo de unión similar al modelo de referencia del Tn antígeno (-OMeGalNAc) hacia diferentes lectinas; ii) Se ha demostrado el carácter bifuncional de un glicano ramificado sintético unido covalentemente a un inhibidor de proteasa y su capacidad para dirigir simultáneamente diferentes proteínas. iii) La especificidad de la interacción de anticuerpos monoclonales dirigidos al xenoantígeno basado en carbohidratos se ha deducido por STD-NMR, mostrando también la existencia de diferentes afinidades para el xenoantígeno -gal y una serie de anticuerpos. En particular, también se ha mostrado la especificidad anomérica de la interacción del antígeno de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) con diferentes anticuerpos. iv) El modo de unión de diferentes cepas de hemaglutininas (HA) del virus de la gripe hacia los epítopos del ácido siálico presentes en los N-glicanos también ha sido elucidado por STD-NMR. Los datos experimentales, combinados con los cálculos de docking, han puesto de manifiesto la existencia de distintos modos de unión, dependiendo de la regioquímica del enlace Neu5Ac

Aplicaciones de RMN a otros sistemas y sistemas dinámicos: Los procesos biológicos son inherentemente dinámicos ya que ligandos y proteínas son capaces de ensamblarse en multitud de conformaciones. El entendimiento de este ambiente dinámico intrínseco es de suma importancia para monitorizar, explicar y modular los eventos de unión y reconocimiento molecular. En este contexto, los métodos de RMN proporcionan una diversidad de estrategias experimentales basadas en parámetros de relajación y / o interacciones dipolares para obtener información sobre el comportamiento conformacional de ligandos y receptores en sus estados libres y enlazados. Además, la RMN también puede aplicarse en sistemas químicos dinámicos, incluyendo la deconvolución de la interacción de bibliotecas combinatorias dinámicas con receptores, un proceso en el que se producen reacciones múltiples reversibles. En este capítulo se describen diferentes ejemplos de aplicación de métodos de RMN al estudio de las características estructurales, conformacionales y dinámicas de sistemas de naturaleza química diversa e interés biológico. En particular, i) se han aplicado métodos de RMN para estudiar el grado de orden de dominios de proteínas mediante el análisis de los parámetros dinámicos de RMN de un fragmento del factor de transcripción CHOP. ii) Se ha realizado análisis conformacional por RMN basado en experimentos tr-NOESY de un derivado sintético de epotilona unido a tubulina revelando un modo de unión similar al descrito para la epotilona-A. iii) La interacción de una familia de moléculas con el surco menor del ADN se ha caracterizado mediante RMN mostrando su especificidad por regiones ricas en A / T. iv) Por último, la aplicación de métodos de RMN al estudio de una química combinatoria dinámica en presencia de una proteína determinada (Frequenin-2) ha permitido la identificación directa no ambigua de nuevos ligandos