Estudios de los cambios topológicos que experimenta el DNA durante la replicación

Abstract

[EN] As replication proceeds DNA replication intermediates (RIs) undergo topological changes that affect supercoiling, catenation and knotting. Nevertheless, the function and dynamics of these changes remain to be fully understood. In this context, the role of DNA replication knots in prokaryotes remains a mystery. DNA knots are very harmful for cells if not removed efficiently. However, sister chromatids become knotted in vivo. To identify the enzyme responsible for knotting and to study inter- and intra-chromatid knots in bacteria, we used Escherichia coli plasmids as a model system. We constructed plasmids bearing a unidirectional ColE1 origin and a polar replication fork barrier located at different distances from the origin. Two-dimensional agarose gel electrophoresis (2D gels) and atomic force microscopy allowed us to confirm the nature of the molecules identified as knotted RIs. In prokaryotes, Topoisomerase IV (Topo IV) unknots DNA molecules. Our results pointed out a possible dual role for Topo IV in knotting: we showed that this enzyme also makes inter- and intra-chromatid knots during DNA replication. We propose that Topo IV artlessly traps nodes when making strand passages, thus creating replication knots. Later on, the same removes them to allow the correct segregation of sister duplexes during cell division. In addition, we investigated the dynamics of Topoisomerase II (Top2)-mediated decatenation of sister chromatids in eukaryotes. Specifically, we investigated the topological changes that occur during mitosis to check whether they help decatenation. We used Saccharomyces cerevisiae as a model system and a centromeric minichromosome, which retains topological information after DNA extraction. The results obtained demonstrated that in yeast, centromeric minichromosomes undergo a dramatic change in their topology as the cells pass through mitosis. This change is characterized by the acquisition of positive supercoiling and requires the mitotic spindle and the condensin factor Smc2. Decatenation is a crucial step for cell reproduction but how it occurs is still poorly understood. Our study sheds light on the dynamics of this process. We showed that the positive supercoiling of catenated minichromosomes maximizes Top2 decatenating activity.

[ES] Durante la replicación del DNA, los intermediarios de replicación (RIs) sufren cambios topológicos que afectan al superenrollamiento, encadenamiento y anudamiento. Los nudos en el DNA tienen consecuencias deletéreas y deben ser eliminados; por ello el papel del anudamiento de las cromátidas hermanas in vivo en procariotas continua siendo un misterio. Para estudiar esos nudos inter-cromátida y tratar de identificar la enzima responsable de anudar las cromátidas hermanas, construimos plásmidos de Escherichia coli con barreras para el avance de la horquilla de replicación. La electroforesis bidimensional en geles de agarosa junto con la microscopía de fuerza atómica nos permitió confirmar la naturaleza de las moléculas identificadas como RIs anudados. En procariotas, la Topoisomerasa IV (Topo IV) es la encargada de desanudar el DNA. Nuestro resultados apuntan a un posible papel dual de la Topo IV en el anudamiento: esta enzima sería también la responsable de crear los nudos inter- e intra-cromátidas durante la replicación. Proponemos un modelo según el cual en la región ya replicada algunos de los pases de hebra catalizados por la Topo IV atraparían cruces de preencadenamiento que conducirían a la formación de nudos. También analizamos el desencadenamiento de las cromátidas hermanas por la Topoisomerasa II (Top2) en eucariotas, para dilucidar si los cambios topológicos en el DNA producidos durante la mitosis favorecen dicho proceso. Para ello estudiamos los cambios topológicos de un minicromosoma circular a lo largo del ciclo de división en Saccharomyces cerevisiae. Nuestros resultados muestran que, al paso de las células por mitosis, los minicromosomas experimentan un cambio topológico drástico a modo de superenrollamiento positivo que requiere del huso mitótico y de la condensina Smc2. El desencadenamiento es un proceso crucial para la vida celular pero se desconoce cómo tiene lugar. Nuestro trabajo profundiza en la comprensión de este fenómeno pues demuestra que el superenrollamiento positivo en moléculas encadenadas maximiza el desencadenamiento de las cromátidas hermanas por parte de la Top2.