Papel de Src quinasas en invasión y de microRNAs en resistencia a quimioterapia en células de melanoma

Abstract

[EN] Introduction: Melanoma shows high aggressiveness once metastasis begins, and the refore it isimportant to identify mechanisms involved in melanoma cell invasion. Chemokin estimulatedcell migration depends on signalling mediated by heterotrimeric G proteins. Gα12/13 proteins have been linked to the regulation of RhoA activity, which plays a major role in actin cytoskeleton reorganization and cell migration. Among the molecules that control RhoA is p190RhoGAP. It has been previously described that Gα13 activation in melanoma cells causes p190RhoGAP activation and subsequent inhibition of RhoA, which leads to blockade of cell invasion. On the other hand, one of the currently used metastatic melanoma treatments is based on specific inhibitors against mutant BRAF (vemurafenib or dabrafenib). This treatment has shown remarkable effectiveness, but invariably develops resistance in the majority of patients. Mechanisms of resistance described for these inhibitors include genetic alterations, although recent studies point out the coexistence of resistances that are not due to these alterations. Consequently, and given the importance of miRNAs in oncogenic and tumor suppressor processes, we decided to determine their potential role in vemurafenib resistance of melanoma cells. Objectives: • Analysis of the contribution of the Gα13-p190RhoGAP-RhoA signalling pathway to melanoma cell invasion. • Generation of melanoma cells resistant to MAP-kinase inhibitors and characterization of mechanisms involved in the resistance. • Analysis of miRNA roles in resistance of melanoma cells to vemurafenib. Methodology For the first objective, we performed specific silencing using siRNAs or overexpression of proteins involved in Gα13-p190RhoGAP-RhoA pathway. Subsequent analyses were performed by coimmunoprecipitation, GTPase activity asssays or cell invasion experiments. Moreover, in vivo studies were conducted in inmunodeficient mice to analyse the invasive potential of the generated transfectants.

For the second and third objectives, we generated melanoma cell lines resistant to MAP-kinases inhibitors. Their characterization has been carried out mainly through cell viability and proliferation assays, and detection of phosphorylation or protein expression by western blotting. Furthermore, RNA-Seq of small RNA was performed with resistant cells. Levels of mRNA or miRNA were detected by qPCR assays. To assess the role of miRNAs in vemurafenib resistance, we generated by lentiviral infection transfectants with stable overexpression or silencing of certain miRNAs. These transfectants were further analysed in cell viability and proliferation assays, as well as by western blotting and qPCR assays. Results The results of this Thesis indicate that the Src kinase Blk is involved in p190RhoGAP tyrosine phosphorylation in cells expressing active Gα13. In the proposed model, activation of Gα13 promotes Blk dissociation from Gα13-Blk complexes and the subsequent binding of this kinase to p190RhoGAP, which leads to phosphorylation of this GAP. This phosphorylation correlates with an increase in RhoA-p190RhoGAP association and with decreased RhoA activity, ultimately inhibiting CXCL12-stimulated cell invasion. Likewise, data show the involvement of Blk in p190RhoGAP tyrosine phosphorylation after CXCL12 stimulation, independently of Gα13. Concerning the second part of the Thesis, A375 vemurafenib resistant cells (A375-VR) were shown to exhibit higher Ras activation, which correlates with increase in MAPkinase and PI3-kinase/AKT pathway activation. In addition, these resistant cells show de novo expression of a BRAF isoform. Also, trametinib resistant cells (A375-TR and SKMel-103-TR) display larger PI3-kinase/AKT activation, but only SK-Mel-103-TR exhibit hyper-activated MAP-kinase pathway. miRNAs sequencing of parental and A375-VR cells, as well as their subsequent validation by qPCR, showed an increase in miR-204-5p and miR-211-5p expression, and decreased miR-140-3p expression in resistant cells relative to parental ones. The alterations in the expression of these miRNAs in A375-VR cells were found to be stable, and their levels change after vemurafenib administration in BRAF V600E mutant melanoma cells, such as A375 or SK-Mel-28 cells. Moreover, treatment with other MAP-kinases inhibitors causes similar changes in the expression of miR-204-5p and miR-211-5p in A375 cells, whereas no alterations were detected after AKT or Rac inhibitor administration. Notably, transfectants overexpressing miR-204-5p or miR-211-5p show increased cell viability and proliferation in the presence of vemurafenib. In contrast, miR-140-3p silencing did not confer a viability advantage in melanoma cells exposed to this inhibitor. Taken together, these results suggest that early tolerance to vemurafenib in A375 cells involves changes in the expression and function of miR-204-5p and miR-211-5p, which could contribute to early stages of resistance to this compound.

Conclusions: The results of this Thesis show the relevance of Blk in the regulation of Gα13- p190RhoGAP-RhoA signalling pathway involved in migration and invasion of melanoma cells. A better understanding of the migration process is essential in melanoma research, due to the high aggressiveness of this cancer once metastasis begins. The identification and characterization of miRNAs miR-204-5p and miR-211-5p as molecules that contribute to vemurafenib resistance in melanoma cells, probably in early stages of resistance, could help to the design of improved therapies for metastatic melanoma treatment.

[ES] Introducción: El melanoma muestra una gran agresividad una vez iniciada la metástasis, y por ello es importante identificar los mecanismos implicados en la invasión de las células de melanoma. La migración celular estimulada por quimioquinas depende de la señalización mediada por proteínas G heterotriméricas. Las proteínas Gα12/13 han sido relacionadas con la regulación de la actividad de RhoA, la cual tiene un papel clave en la reorganización del citoesqueleto de actina y en la migración celular. Una de las moléculas que controlan la activación de RhoA es p190RhoGAP. Previamente se ha descrito que la estimulación de Gα13 en células de melanoma provoca la activación de p190RhoGAP y la posterior inhibición de RhoA, lo que causa un bloqueo de la invasión celular. Por otra parte, uno de los tratamientos contra el melanoma metastásico utilizados actualmente se basa en la administración de inhibidores específicos frente a BRAF mutado (vemurafenib o dabrafenib). Este tratamiento ha mostrado una notable efectividad, pero genera resistencia en la mayoría de pacientes. Los mecanismos de resistencia descritos para estos inhibidores incluyen alteraciones genéticas, aunque estudios recientes apuntan a la coexistencia de resistencias que no se basan en dichas alteraciones. Por ello, dada la importancia de los miRNAs en los procesos oncogénicos y de supresión de tumores, se decidió analizar su potencial participación en la resistencia a vemurafenib de células de melanoma. Objetivos: • Análisis de la contribución de la vía de señalización Gα13-p190RhoGAP-RhoA en la invasión de células de melanoma. • Generación de células de melanoma resistentes a inhibidores de la vía de las MAPquinasas y caracterización de los mecanismos implicados en la resistencia. • Análisis de la implicación de miRNAs en la resistencia a vemurafenib de células de melanoma.

Metodología: Para el primer objetivo se ha realizado una aproximación experimental basada en el silenciamiento específico mediante siRNAs o sobre-expresión de proteínas implicadas en la vía de señalización Gα13-p190RhoGAP-RhoA. El análisis posterior ha sido realizado mediante ensayos de co-inmunoprecipitación, de actividad GTPasa o de invasión celular. Asimismo, se han llevado a cabo estudios in vivo en ratones inmunodeficientes para analizar el potencial invasivo de los transfectantes generados. Para el segundo y tercer objetivo se han generado líneas celulares de melanoma resistentes a inhibidores de la vía de las MAP-quinasas. Su caracterización ha sido realizada principalmente mediante ensayos de viabilidad, proliferación y detección de la fosforilación o expresión de proteínas mediante western blotting. Asimismo, se ha realizado RNA-Seq de RNA de pequeño tamaño con las células resistentes. Los niveles de mRNA o miRNAs fueron detectados mediante ensayos de qPCR. Para determinar el papel de miRNAs en la resistencia a vemurafenib se generaron mediante infección lentiviral transfectantes con sobre-expresión o silenciamiento estable de determinados miRNAs. Estos transfectantes fueron posteriormente analizados en ensayos de viabilidad, proliferación, western blotting y qPCR. Resultados: Los resultados de esta Tesis muestran que la Src quinasa Blk está implicada en la fosforilación en tirosinas de p190RhoGAP en células de melanoma que expresan Gα13 activo. En el modelo que se propone, la activación de Gα13 promueve la disociación de Blk del complejo Gα13-Blk y la posterior unión de esta quinasa a p190RhoGAP, lo que se traduce en fosforilación de esta GAP. A su vez, esta fosforilación correlaciona con una mayor unión RhoA-p190RhoGAP y con la disminución de la actividad de RhoA, lo que finalmente provoca la inhibición de la invasión celular estimulada por CXCL12. Asimismo,los resultados indican la participación de Blk en la fosforilación de p190RhoGAP tras estimulación con CXCL12, independientemente de Gα13. En relación con la segunda parte de la Tesis, las células A375 resistentes a vemurafenib (A375-VR) exhiben una mayor activación de Ras, lo que correlaciona con el aumento de la activación de la vía de señalización de las MAP-quinasas y de la vía PI3-quinasa/AKT. Asimismo, estas células resistentes muestran una expresión de novo de una isoforma de BRAF. Por otra parte, las células resistentes a trametinib (A375-TR y SK-Mel-103-TR) tienen en común una mayor activación de PI3-quinasa/AKT, pero sólo las células SK-Mel-103-TR tienen sobre-activada la vía de las MAP-quinasas.

La secuenciación de miRNAs en las células parentales y A375-VR, así como su posterior validación mediante qPCR, mostró un aumento en la expresión de miR-204-5p y miR-211-5p, así como una disminución de los niveles de miR-140-3p en las células resistentes relativo a las parentales. Las alteraciones en la expresión de estos miRNAs en las células A375-VR son estables, y además su expresión varía tras la administración de vemurafenib en células de melanoma con mutación en BRAF V600E, como las células A375 o SK-Mel-28. Adicionalmente, el tratamiento con otros inhibidores de la vía de las MAP-quinasas genera cambios similares en la expresión de miR-204-5p y miR-211-5p en células A375, mientras que no se detectaron alteraciones tras la administración de inhibidores de AKT o Rac. Notablemente, los transfectantes que sobre-expresan miR-204- 5p o miR-211-5p presentan un aumento de viabilidad y proliferación celular en presencia de vemurafenib. Por el contrario, el silenciamiento de miR-140-3p no se tradujo en ventajas de viabilidad en las células de melanoma expuestas a dicho inhibidor. En conjunto, los resultados sugieren que la tolerancia temprana al vemurafenib de las células A375 implica cambios en la expresión y función de miR-204-5p y miR-211-5p, lo que podría contribuir a las primeras etapas de la resistencia a dicho fármaco. Conclusiones: Los resultados de la presente Tesis muestran la relevancia de Blk en la regulación de la vía Gα13-p190RhoGAP-RhoA, la cual está implicada en la migración e invasión de células de melanoma. Una mayor comprensión de los procesos de migración es fundamental en el estudio del melanoma, debido a la alta agresividad de este cáncer una vez iniciado el proceso de metástasis. La identificación y caracterización de los microRNAs miR-204-5p y miR-211-5p como elementos que contribuyen a la resistencia de células de melanoma a vemurafenib, probablemente en estadios iniciales de la resistencia, podrían ayudar al diseño de futuras terapias para el tratamiento del melanoma metastásico.