Implicación del receptor AhR en neuroprotección y neurorreparación en ictus isquémico experimental

Abstract

[EN] AhR (Aryl hydrocarbon receptor) is a transcription factor that belongs to the bHLH (basic helix-loop-helix)/PAS(Per-Arnt-Sim homology domain) family of highly conserved proteins. One of the main known functions of AhR is to mediate the toxic and carcinogenic effects of xenobiotics. Furthermore, several evidences indicate a physiological role of this receptor in normal cell physiology and function. Although AhR is widely expressed in the CNS (Central Nervous System), its physiological and pathological roles are stillunclear. To further define the roles of this receptor in normal and pathologic brain function, we decided to explore the contribution of AhR to cerebral ischemic damage caused by permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) and oxygen-glucose deprivation (OGD). The results presented in this Thesis show for the first time that AhR is induced after different experimental models of cerebral ischemia with specific temporal and regional profiles. In this context, AhR is mainly located in neurons placed in peri-infarct areas surrounding core region. Pharmacological or genetic loss-offunction approaches using the AhR antagonists 2',4',6-trimethoxyflavone (TMF) and CH-223191 (CH) (Murray et al., 2010a; Zhao et al., 2010) or AhR heterozygous mice (Fernández-Salguero et al., 1995) resulted in neuroprotection in our in vitro and in vivo models of brain ischemia and excitotoxicity.

Furthermore, cerebral ischemia induced AhR nuclear translocation and its transcriptional activity. Since AhR is a ligand activated transcription factor, we decided to determine whether L-kynurenine (L-Kyn), a metabolite of tryptophan degradation through the so called “Kynurenine pathway” and recently described as an AhR agonist in different contexts (Adams et al., 2012; DiNatale et al., 2010; Hao et al., 2013; McBerry et al., 2012; Opitz et al., 2011), was responsible for AhR activation after cerebral ischemia. Indeed, cerebral and plasmatic L-kynurenine levels were induced as a consequence of ischemic damage in mouse (Graphical abstract, 1). This result suggests the possibility that, after cerebral ischemia, AhR activation in neurons is mediated by this tryptophan metabolite. Different experimental approaches in our in vitro and in vivo models confirmed L-kynurenine as an endogenous ligand of AhR after brain ischemia. In addition, exogenous L-kynurenine treatment or, inhibition of endogenous L-kynurenine synthesis by administration of TDO (tryptophan-2,3-dioxygenase) inhibitor resulted in AhR-dependent signaling modulation. In our experimental models of cerebral ischemia, AhR activation by L-kynurenine or endogenous L-kynurenine synthesis inhibition resulted in increased brain damage or neuroprotection, respectively. Therefore, our data demonstrate that AhR activation by L-kynurenine participates in deleterious mechanisms that mediate neuronal death in the acute phase of cerebral ischemia. The mechanisms through which AhR activation participates in ischemic damage include transcriptional processes (Graphical abstract, 2) but also a novel mechanism by which AhR is recruited to the neuronal membrane (Graphical abstract, 4).

In the first ones, nuclear AhR translocation produces an increase in AhR target genes such as Cyp1a1, AhRR and Cyp1b1 (Graphical abstract, 3) but, in addition, promotes AhR interaction with CBP (CREB binding protein) and CREB (Cyclic adenosine monophosphate response element binding). This AhR/CBP/CREB complex decreases CREB transcriptional activity and therefore the expression of the CREB survival target genes BDNF (Brain derived neurotrophic factor) and NPAS4 (Neuronal PAS 4). In the second mechanism, AhR activation by an agonist (Graphical abstract, 4) induces the recruitment of this receptor to the neuronal plasma membrane. There, AhR interacts with the MAGUK (Membrane associated guanilate kinase) protein Sap102 (synapse associated protein 102) and, as a consequence, total and membrane Sap102 protein levels are decreased. Although we do not know exactly the mechanism responsible of this AhR dependent regulation of Sap102, it is possible that, in this context, AhR acts like a ligand activated E3 ubiquitin ligase, a AhR function that has been previously demonstrated (Barouche et al., 2007; Bock y Kohl, 2006; Harper et al., 2006; Oesch-Bartlomowicz et al., 2005; Ohtake et al., 2007), promoting Sap102 degradation by 26S proteosome system (Graphical abstract, 5). Decreased Sap102 levels allow the movement of NR2B receptors from synaptic to extrasynaptic sites (Graphical abstract, 6) or modulate Sap102/NR2B-dependent endocytosis and exocytosis processes (Rudinskiy et al., 2009; Sans et al., 2005; 2000). The final effect is an increase in NMDA receptors composed by NR1/NR2B subunits in extrasynaptic sites. This effect is dependent of AhR activation. Furthermore, overactivation of these extrasynaptic NMDA receptors mediates an increase in intracellular [Ca2+] (Graphical abstract, 7) that cause a decrease in CREB phosphorylation (Graphical abstract, 8). Therefore, the inhibition of NMDA-dependent survival pathways together with the potentiation of NMDA-induced deleterious mechanisms would lead to neuronal death after AhR activation in cerebral ischemia.

[ES] El receptor de hidrocarburos de arilo (AhR) es un factor de transcripción que pertenece a la familia de proteínas altamente conservadas bHLH (dominio hélice-bucle-hélice)/PAS(Per-ARNT-Sim). Una de las principales funciones de AhR es mediar los efectos tóxicos y carcinogénicos de los xenobióticos. Sin embargo, cada vez son más las evidencias que indican un importante papel del receptor en funciones fisiológicas. Aunque AhR se expresa ampliamente en el SNC (Sistema Nervioso Central) sus funciones a nivel fisiológico y patológico en esta estructura son aún desconocidas. Con el fin de profundizar en la función fisiológica y patológica del receptor AhR en el cerebro, decidimos explorar la contribución de AhR al daño isquémico ocasionado por la oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO) y la privación de oxígeno y glucosa (OGD). Los resultados presentados en esta Tesis doctoral muestran por primera vez cómo tras modelos experimentales de isquemia cerebral, la expresión del receptor AhR se incrementa siguiendo un patrón temporal y espacial concreto. Este incremento en la expresión del receptor presenta una localización principalmente neuronal. La inhibición del receptor AhR mediante los antagonistas específicos 2',4',6-trimetoxiflavona (TMF) y CH-223191 (CH) (Murray et al., 2010a; Zhao et al., 2010) o a través del uso de ratones heterocigotos para AhR (Fernández-Salguero et al., 1995) resultó neuroprotectora en nuestros modelos de isquemia cerebral y excitotoxicidad in vitro e in vivo.

AhR es un receptor activado por ligando, y ya que tras la isquemia el receptor incrementa no solo su traslocación al compartimento nuclear sino también, su actividad transcripcional, decidimos evaluar si la L-kinurenina, un metabolito derivado de la degradación del triptófano a través de “la ruta de la kinureninas” recientemente descrito como agonista de AhR en diferentes contextos (Adams et al., 2012; DiNatale et al., 2010; Hao et al., 2013; McBerry et al., 2012; Opitz et al., 2011), era el responsable de la activación del receptor AhR tras la isquemia cerebral. En efecto, los niveles cerebrales de L-kinurenina en el cerebro y a nivel plasmático se inducían como consecuencia de la isquemia (Sumario gráfico, 1), lo que sugería la posibilidad de que la activación de AhR tras la isquemia cerebral estuviese mediada por este metabolito. Los experimentos realizados in vitro e in vivo confirmaron a la L-kinurenina como ligando endógeno de AhR tras la isquemia. De hecho, la modulación de la ruta de las kinureninas mediante la adición de L-kinurenina exógena o mediante la inhibición de la síntesis endógena a través del bloqueo selectivo de la enzima TDO (Triptófano- 2,3-dioxigenasa), modularon la señalización mediada por el receptor AhR. En nuestros modelos de isquemia experimental, la activación de AhR por Lkinurenina, y la inhibición de AhR mediante antagonistas específicos o por la inhibición de la síntesis endógena de L-kinurenina, se tradujeron en un incremento del daño producido por la isquemia y en neuroprotección, respectivamente. Por tanto la activación de AhR a través de L-kinurenina en la fase aguda del ictus isquémico participa en los mecanismos asociados al daño que median la muerte neuronal.

Dentro de los mecanismos a través de los cuales la activación del receptor participa en el daño isquémico se incluyen, por un lado, mecanismos a nivel transcripcional (Sumario gráfico, 2) y, por el otro, un novedoso mecanismo que implica el reclutamiento de AhR a la membrana neuronal (Sumario gráfico, 4). En el primero de ellos, la traslocación de AhR al compartimento nuclear, además de incrementar la transcripción de sus genes diana típicos Cyp1a1, AhRR y Cyp1b1 (Sumario gráfico, 3), interaccionaría con CBP y CREB. La formación de los complejos AhR/CBP/CREB disminuiría la actividad transcripcional de CREB (Sumario gráfico, 3) y, por tanto, la expresión de sus genes diana, entre los que se incluyen BDNF y NPAS4. En el segundo mecanismo, gracias al reclutamiento de AhR a la membrana al ser activado por ligando (Sumario gráfico, 4) y a la interacción del receptor con la proteína MAGUK Sap102, AhR reduciría los niveles totales y de membrana de la proteína Sap102. Aunque no hemos esclarecido el mecanismo a través del cual se produce esta regulación, es probable que, en este caso, AhR actúe a modo de E3 ubiquitina ligasa activada por ligando (Barouki et al., 2007; Bock y Köhle, 2006; Harper et al., 2006; Oesch-Bartlomowicz et al., 2005; Ohtake et al., 2007), promoviendo la degradación de Sap102 a través del proteasoma 26S (Sumario gráfico, 5). Esta disminución de los niveles de Sap102 permitiría el movimiento de los receptores NMDA de tipo NR2B desde los sitios sinápticos hasta los extrasinápticos (Sumario gráfico, 6), o bien modularía los procesos de endocitosis/exocitosis dependientes de la interacción de Sap102 y NR2B (Rudinskiy et al., 2009; Sans et al., 2005; 2000). El efecto final sería un incremento de los niveles del receptor NMDA de tipo NR1/NR2B en los sitios extrasinápticos tras la activación de AhR. La sobreactivación de estos receptores extrasinápticos mediaría un incremento en la [Ca2+] intracelular (Sumario gráfico, 7), disminuyendo la fosforilación del factor de transcripción CREB (Sumario gráfico, 8), y dando por tanto lugar a la inhibición de las rutas de supervivencia y la potenciación de las rutas de señalización que conducirían, de manera inevitable, a la muerte de la neurona.