Efecto de mutaciones genéticas puntuales en la actividad enzimática de FAD3, una enzima implicada en la producción de ácidos grasos ω3

Abstract

[ES] Las desaturasas de ácidos grasos son enzimas que introducen un enlace doble o insaturado en la cadena alquílica de un ácido graso. La mayoría de estas enzimas son proteínas de membrana con fuerte carácter hidrofóbico lo que complica su purificación y cristalización por lo que se desconoce su estructura y los residuos que constituyen su centro activo. Se sabe que presentan 3 cajas de histidinas que están muy conservadas entre las distintas desaturasas y entre diferentes especies vegetales y se cree que estas cajas de histidinas podrían participar coordinando átomos de hierro para la reacción de insaturación, en un mecanismo básicamente desconocido. Existen mutantes de la planta modelo Arabidopsis thaliana deficientes en la insaturación de ácidos grasos cuyo estudio permitirá identificar residuos implicados en la función de las ω3 desaturasas. En este trabajo se clonó el gen FAD3 (que codifica para una ω3 desaturasa reticular) de tres líneas vegetales (Arabidopsis thaliana silvestre, mutante fad3 y mutante fad378) en el vector pGEM-T Easy y se llevaron a cabo reacciones de secuenciación detectando una mutación puntual en el aminoácido 103 del mutante fad378 y otra mutación puntual en el aminoácido 292 del mutante fad3. Puesto que estas mutaciones puntuales anulan la actividad desaturasa de FAD3 se puede decir que los aminoácidos de las posiciones citadas son imprescindibles para la actividad enzimática, ya sea porque forman parte de su centro activo o porque están implicados en el correcto plegamiento de la enzima.

[EN] Fatty acid desaturases are enzymes that introduce a single bond between two carbon atoms in a double or unsaturated bond in the alkyl chain of the fatty acids. Most of these enzymes are membrane proteins with high hydrophobic character which complicates their purification and crystallization. Accordingly, their structure and the residues of their active site are unknown. It is known that these kind of proteins have three histidine boxes that are highly conserved between different desaturases and between species of plants and it is believed that these histidine boxes could participate in the reaction of unsaturation by binding iron atoms to the protein through a mechanism that is completely unknown. There are Arabidopsis thaliana mutants deficient in fatty acid unsaturation that could be used to identify residues involved in the function of ω3 desaturases. In this project, the FAD3 gene (that encodes a ω3 reticular desaturase) of three plant lines (wild type Arabidopsis thaliana, fad3 mutant and fad378 mutant) was cloned into the plasmid pGEMT-T Easy. Then, the genes were sequenced and two punctual mutations were detected. One was located in the residue 103 of the fad378 mutant and the other was in the residue 292 of the fad3 mutant. Because these punctual mutations inhibit the FAD3 desaturase activity it is possible that the amino acids of described positions are essential for protein function, either because they are part of the active site or are involved in the correct folding of the enzyme.