Caracterización funcional de Snail2 como represor de cadherina-E y como regulador del proceso de carcinogénesis química

Abstract

[ES]: La pérdida de expresión de la proteína de adhesión intercelular cadherina-E es un evento esencial en el proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) que permite la migración celular durante el desarrollo embrionario y la invasión de las células tumorales de origen epitelial (carcinomas). La represión transcripcional es uno de los principales mecanismos de regulación de la expresión de cadherina-E, tanto en el desarrollo embrionario como durante la progresión tumoral. En los últimos años se han caracterizado diferentes represores transcripcionales del gen de cadherina-E, que a su vez inducen TEM, entre los que se encuentran los factores de dedos de zinc de la familia Snail (Snail1 y Snail2) y ZEB (ZEB-1 y ZEB-2), así como los factores de la familia bHLH (E47, E2-2 y Twist). Estudios previos de nuestro laboratorio de analisis de perfiles de expresión génica demostraron que los factores Snail1, Snail2 y E47 inducen programas genéticos comunes y específicos, apoyando un papel no redundante de los distintos factores, en particular de Snail1 y Snail2, en la invasión y progresión tumoral. En estudios previos se había caracterizado el mecanismo de represión de Snail1 y puesto de manifiesto diferencias significativas en la afinidad de los factores Snail1 y Snail2 por las cajas-E del promotor de cadherina-E. Sin embargo, se desconocen los mecanismos específicos de represión mediados por Snail2. Esta tesis ha analizado los mecanismos transcripcionales utilizados por Snail2 para la represión transcripcional de cadherina-E así como su papel en el proceso de carcinogénesis química. Los estudios bioquímicos mostraron que Snail2 precisa de los dominios SNAG (dominio común a Snail y Gfi-1) y SLUG para el reclutamiento de distintos co-represores, como mSin3A, NCoR y CtBP1.Estos co-represores interactúan entre sí durante la represión transcripcional de cadherina-E. Además, se han identificado diferentes residuos fosforilables de Snail2 in vivo capaces de regular su actividad represora. Finalmente, el análisis funcional de los dedos de zinc desveló que si bien el segundo dedo de zinc de Snail2 es esencial para la represión de cadherina-E, el quinto dedo de zinc tiene una función dependiente del contexto del promotor, modificando la capacidad de represión de Snail2 según la estructura del mismo. Estos resultados señalan diferencias entre los mecanismos de represión transcripcional de Snail1 y Snail2, apoyando las diferencias funcionales entre ambos factores. Los estudios de proliferación realizados en la piel de ratones control y Snail2 -/- mostraron que Snail2 es esencial para la proliferación de los queratinocitos in vitro y el programa de diferenciación in vivo. Sin embargo, la ausencia de Snail2 aumenta significativamente el número de lesiones y la progresión maligna de tumores inducidos por carcinogénesis química, mediante el protocolo de DMBA/TPA. El análisis detallado de las lesiones reveló que la ausencia de Snail2 favorece la proliferación e inhibe parcialmente la diferenciación terminal en las lesiones, contribuyendo así a la progresión tumoral. El tratamiento de ratones carentes de Snail2 con antiinflamatorios reduce la progresión maligna de las lesiones inducidas por DMBA/TPA pero no la aparición y el crecimiento de lesiones benignas. Estos resultados sugieren una alteración importante de la respuesta inflamatoria en ausencia de Snail2, que a su vez puede contribuir en la mayor progresión maligna.

[EN]: Loss of expression of the intercellular adhesion protein E-cadherin is a key event in the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), which allows cell migration during embryonic development and invasion of tumor cells of epithelial origin (carcinomas). One of the main mechanisms of negative regulation of E-cadherin expression during both embryonic development and tumor progression is transcriptional repression. Recently, different transcriptional repressors of E-cadherin gene, which in turn induce TEM, have been identified including the zinc finger family of Snail (Snail1 and Snail2) and ZEB (ZEB - 1 and ZEB-2) factors and the bHLH family (E47, E2-2 and Twist). Previous gene expression profiles studies from our laboratory, identified common and specific genetic programs induced by Snail1, Snail2 and E47, supporting a non redundant role for these factors, particularly for Snail1 and Snail2, during invasion and tumor progression. Previous studies about Snail1 repression mechanism revealed significant differences in the affinity of Snail1 and Snail2 for the E-boxes of E-cadherin promoter. However, the specific repression mechanisms mediated by Snail2 are unknown. In this thesis the mechanisms used by Snail2 for transcriptional repression of E-cadherin and its role in the process of chemical carcinogenesis in mice heve been analized. Biochemical approaches have shown that the SNAG (Snail and Gfi-1) and SLUG domains of Snail2 are required for the recruitment of different co-repressors, such as mSin3A, NCoR and CtBP1. These corepressors functionally interact during transcriptional repression of E-cadherin gene. In addition, several in vivo phosphorylated residues able to modulate Snail2 funtional activity have been identified. Finally, functional analysis of the zinc fingers of Snail2 revealed that while the second zinc finger is essential for the repression activity of Snail2, the fifth zinc finger is required depending on the promoter context and structure. These results highlight the differences between the mechanisms of transcriptional repression of Snail and Snail2, supporting the non redundant function of both factors. On the other hand, proliferation and wound healing studies in the skin of control or Snail2 -/- mice showed that Snail2 is essential for in vivo proliferation of keratinocytes and for their differentiation program end. However, the absence of Snail2 significantly increases malignant progression of tumors induced by DMBA/TPA protocol of skin chemical carcinogenesis. In-depth analysis of the lesions revealed that the absence of Snail2 favors proliferation and partial inhibition of their terminal differentiation, thereby contributing to tumor progression. Anti-inflammatory treatment of Snail2 -/- mice reduces malignant progression of the lesions induced by DMBA/TPA but not the emergence and growth of benign lesions. These results suggest significant alterations of the inflammatory response in the absence of Snail2, which in turn may be causing the acute malignant progression.