Diferenciación de las células troncales embrionarias humanas hacia un linaje beta-pancreático: estudios enfocados a procesos de maduración

Abstract

Las células troncales embrionarias humana (CTEh) tienen la capacidad de diferenciar hacia todos los tejidos que componen el cuerpo adulto, incluido las células ß del páncreas endocrino. No obstante, un protocolo para la diferenciación de las CTEh hacia células ß-pancreáticas maduras y funcionales que sea eficiente y reproducible no ha sido todavía generado. El objetivo general de este trabajo de tesis ha sido la optimización de un protocolo de diferenciación de las CTEh hacia un fenotipo ß-pancreático que reproduzca las etapas del desarrollo embrionario del páncreas y el estudio del papel del RSV en la etapa de maduración para la obtención de una nueva y más eficaz estrategia de diferenciación. Para ello primero se ha estudiado el efecto del RSV en una línea celular de insulinoma (INS-1E) describiendo la vía de SIRT1/Ucp2 como posible mecanismo de acción. Sucesivamente, basándonos en las vías de señalización y los factores de crecimiento involucrados en el desarrollo embrionario del páncreas se ha diseñado un protocolo de diferenciación capaz de dirigir las CTEh hacia células ß-pancreáticas. Para comprobar la eficacia del protocolo de diferenciación las células han sido recogidas a diferentes etapas del protocolo y han sido caracterizadas mediante Q-PCR para la expresión de factores de transcripción que son claves en el desarrollo de las células ß. Al final del protocolo de diferenciación las células expresan marcadores de páncreas endocrino y células ß maduras como PDX1, GLUT2, GK, NKX2.2, INS, GCG, entre otros. Resultados similares se han obtenidos aplicando el protocolo de diferenciación a otro tipo de células troncales pluripotentes, la línea celular pluripotente inducida (hiPS) MSUH001. También se ha demostrado que el tratamiento con RSV durante la etapa final del protocolo de diferenciación mejora el proceso de maduración de los precursores ß-pancreáticos permitiendo duplicar el número de células productoras de insulina obtenidas. Las células tratadas con RSV presentan un incremento en la expresión de PDX1, un mayor contenido de insulina y son capaces de normalizar transitoriamente la glucemia in vivo tras el trasplante en ratones diabéticos. Finalmente se ha propuesto la activación de las vías de señalización responsables de la activación de la transcripción de PDX1 como mecanismo de acción mediante el cual el RSV mejora el proceso de maduración de las células en proceso de diferenciación. En conclusión en este trabajo de tesis se describe un protocolo de diferenciación de múltiples etapas capaz de diferenciar las células troncales pluripotentes hacia células ß-pancreáticas de forma eficiente y reproducible demostrando la implicación del RSV como factor clave en los procesos de maduración.