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Título

Studies on the effects of persistent RNA priming on DNA replication and genomic stability

AutorStuckey, Ruth
DirectorWellinger, Ralf Erik
Fecha de publicación2014
EditorCSIC-JA-UPO-USE - Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER)
Universidad de Sevilla
Resumen[EN]: DNA replication and transcription take place on the same DNA template, and the correct interplay between these processes ensures faithful genome duplication. DNA replication must be highly coordinated with other cell cycle events, such as segregation of fully replicated DNA in order to maintain genomic integrity. Transcription generates RNA:DNA hybrids, transient intermediate structures that are degraded by the ribonuclease H (RNaseH) class of enzymes. RNA:DNA hybrids can form R-loops, three-stranded, thermodynamically stable forms of the RNA:DNA hybrid, which have been shown to challenge replication and genome integrity. Replication is initiated during S phase from defined replication origins and requires the activity of specialized DNA “primases” to provide the RNA to prime DNA synthesis. However, it has been shown that RNA:DNA hybrids can function to initiate replication in bacteriophage T7, E.coli plasmids, or mitochondrial DNA, Here we describe, for the first time in a eukaryotic genome, the formation of replication intermediates that are indicative of RNA:DNA hybridmediated replication in the ribosomal DNA of S. cerevisiae. These unscheduled replication events were transcription dependent and induced by increased torsional stress due to the elimination of Top1 activity. We named this process “transcription-initiated replication” (TIR) and suggest that it may have important roles in genetic diseases and evolution. By genetic dissection we demonstrate
that cells lacking RNaseH activity depend on homologous recombination and post-replicative repair pathways in order to deal with the deleterious impact of R-loops. Special emphasis is given to the observation that the MRC1- complex, considered as a mediator of the replication checkpoint, is very important to tolerate the lack of RNaseH activities. Our data indicate that replication bypass of R-loops may rely on the Mrc1-dependent but Rad53-independent stabilization of replication forks, or suggest that the MRC1-complex has a yet to be defined role in genomic stability. Finally, we show that R-loops constrain chromosome segregation and nucleolar organisation. As a consequence, the action of the phosphatase Cdc14 (a key player in mitotic exit) is constrained and accordingly, we observe a misregulation of B-type cyclins. Thereby, R-loops lead to premature entry into S-phase and promote apoptotic events. The absence of RNaseH activity had previously been linked to embryonic lethality in mice lacking RNaseH1 activity, and the neurological disorder Aicardi-Goutieres syndrome (AGS) in humans lacking RNaseH2 activity. The findings presented in this thesis extend these observations and highlight the importance of proficient R-loop processing in genome stability and evolution.
[ES]: La replicación y la transcripción del ADN suceden al mismo tiempo y en la misma molécula de ADN de modo que su correcta interacción asegura la duplicación precisa del material genético. La replicación del ADN se debe también coordinar con otros eventos del ciclo celular, como la segregación de los cromosomas replicados para, de este modo, mantener la estabilidad del genoma. La transcripción forma híbridos de ARN:ADN, estructuras intermediarias transitorias que son degradadas por unas enzimas denominadas ribonucleasas H (RNasaH). Los “R-loops” de triple hebra son formas termodinámicamente estables de los híbridos de ARN:ADN cuya acumulación puede comprometer la replicación e integridad del genoma. La replicación del ADN se inicia durante la fase S a partir de orígenes de replicación bien definidos y requiere la actividad de primasas especializadas para generar cebadores de ARN para la síntesis del ADN. No obstante en procariotas como el bacteriófago T7 o plásmidos de E.coli, y en el ADN mitocondrial, los híbridos ARN:ADN pueden iniciar replicación fuera del origen. En esta tesis, describimos por primera vez en un genoma eucariota la formación de intermediarios de replicación que indican una iniciación de replicación mediada por híbridos ARN:ADN en el ADN ribosómico de S. cerevisiae. Estos eventos de replicación no programadas son dependientes de la transcripción e inducidos por el aumento de estrés torsional como consecuencia de la eliminación de la actividad de Top1. Nombramos este proceso replicación iniciada por transcripción (TIR pos sus siglas en inglés) y sugerimos que estos eventos pueden ser altamente mutagénicos siendo de particular relevancia en enfermedades genéticas así como para la evolución. Mediante análisis genético demostramos que las células que no poseen actividades RNasaH depende de las vías de reparación de daño en el ADN de la recombinación homologa y la reparación post-replicativa para enfrentarse a los impactos perjudiciales de los R-loops. De particular importancia es el hecho que el complejo MRC1, un mediador del checkpoint replicativo, es fundamental para tolerar la falta de actividad de RNasaH. Nuestros datos indican que el “bypass” replicativo de los R-loops podría depender de la estabilidad de las horquillas de replicación mediada por Mrc1 pero independiente de Rad53 o puede apuntar a un papel novedoso y sin definir del complejo MRC1. Por último, demonstramos que los R-loops provocan dificultades en la segregación de los cromosomas y la organización nucleolar. Como consecuencia, decrece la acción de la fosfatasa Cdc14 (un factor clave en la salida de mitosis) y, en concordancia, observamos un misregulación de las ciclinas de tipo B. Así, la acumulación de R-loops lleva a una entrada prematura en la fase S y promueven eventos apoptóticos. En estudios previos se ha relacionado la ausencia de la actividad RNasaH con mortalidad embrionaria en ratones que no poseen RNasaH1 y la enfermedad neurológica del síndrome de Aicardi-Goutières (AGS) en humanos que no poseen RNasaH2. Los hallazgos presentados en esta tesis amplían este conocimiento y destacan la importancia del procesamiento de los R-loops en la estabilidad del genoma y la evolución.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/131330
Aparece en las colecciones: (CABIMER) Tesis
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