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Por favor, use este identificador para citar o enlazar a este item: http://hdl.handle.net/10261/130365
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Título

Quantitative analysis of cellular behaviour during zebrafish optic cup morphogenesis

AutorNicolás-Pérez, María
DirectorMartínez-Morales, Juan Ramón
Fecha de publicación2014
EditorCSIC-JA-UPO - Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD)
ResumenDurante el desarrollo embrionario las células sufren una serie de procesos morfogenéticos altamente acoplados y regulados para formar tejidos y órganos complejos que darán lugar al individuo adulto. Por tanto, la morfogénesis se define como un conjunto de procesos biológicos que reorganizan las células y los tejidos para constituir todas las formas de vida conocidas. Los organismos siguen un programa genético que define el orden en el que se suceden los procesos morfogenéticos según un plan corporal conservado. Existen muchos estudios acerca de los mecanismos moleculares que hay detrás de estos procesos altamente regulados (Lecuit et al. 2007). Estos procesos hacen que muchas características celulares tales como la forma o la polaridad se modifiquen según la función y/o la localización que las células tendrán en el organismo. De entre las características celulares que se pueden ver afectadas, resaltaremos la polaridad (distribución asimétrica de componentes celulares en la membrana), las uniones celulares (que conectan las células con otras células o con el sustrato y permiten la transmisión de fuerzas de unas células a otras), los cambios de forma, que se deben a la reorganización del citoesqueleto de actomiosina, la migración celular y la división celular, que tiene lugar en la superficie apical de los epitelios (Harris et al. 2014; Mammoto et al. 2010; Nelson 2009; Sauer 1935). La relación entre todas estas características también se puede modificar durante el desarrollo de un órgano concreto. La alteración de estas características o de la relación existente entre ellas puede conducir a situaciones patológicas (Thiery et al. 2009). Por tanto, entender los mecanismos que subyacen al desarrollo y funcionamiento de tejidos y órganos, puede ayudar a prevenir y tratar enfermedades. Dado que muchos tejidos del organismo adulto son, o fueron epitelios en algún momento del desarrollo, el estudio de las hojas epiteliales, constituidas por células polarizadas que se extienden desde una superficie apical hasta una lámina basal, permite conocer los mecanismos que subyacen a la morfogénesis de los epitelios en diversas especies (Bryant et al. 2008; Lecuit et al. 2007). La morfogénesis epitelial depende de la relación entre uniones celulares, cambios de forma y tensión cortical. Estudios recientes han demostrado que los cambios de forma celulares se producen mediante el comportamiento oscilatorio de la red de actomiosina. Dicha red se recluta y se dispersa, bien en la superficie apical o basal de las células, produciendo contracción y relajación de la membrana respectivamente (Gorfinkiel et al. 2011). De entre todos los procesos morfogenéticos, el más conocido en los epitelios animales es la constricción apical. La constricción apical consiste en una disminución de área en la superficie apical de la célula que hace que éstas cambien su forma columnar inicial a una forma cónica. Sin embargo, la relevancia de la constricción apical reside en que puede producir un cambio irreversible mediante el llamado >mecanismo de trinquete> que da lugar a la invaginación de una hoja epitelial, es decir, el plegamiento de un epitelio plano para formar un órgano con estructura tridimensional (Martin et al. 2009; Sawyer et al. 2010). Este proceso esresponsable de la gastrulación de Drosophila, y Xenopus, asi como de la morfogénesis del tubo neural y la formación de la lente en vertebrados (Sawyer et al. 2010). Aunque menos conocida que la constricción apical, este fenómeno de contracción
(cambio reversible) y constricción (cambio irreversible) también afecta a la superficie basal. Algunos ejemplos de ello podrían explicar el crecimiento de la cámara ovárica de Drosophila, el desarrollo del sistema nervioso o la morfogénesis del ojo de vertebrados (Gutzman et al. 2008; He et al. 2010; Martinez-Morales et al. 2009). Y es precisamente la morfogénesis del ojo el sistema elegido como modelo en este trabajo para aclarar los mecanismos que producen la constricción basal. La morfogénesis del ojo de vertebrados se puede dividir en cuatro fases; evaginación, elongación, invaginación y rotación (Kwan et al. 2012). Durante la evaginación, las células que forman el campo óptico en el cerebro anterior migran bilateralmente para formar las vesículas ópticas a ambos lados del embrión (Rembold et al. 2006). En el pez cebra se ha visto que hay dos poblaciones celulares distintas; las células marginales que muestran polaridad apico-basal y las células del núcleo que no muestran polaridad (Ivanovitch et al. 2013). Para formar las vesículas ópticas, estas células experimentan una constricción apical. Durante la invaginación, por el contrario, el mecanismo sugerido para la formación de la copa óptica es la constricción basal. En embriones del pez medaka, la proteína transmembrana Opo regula la endocitosis de integrinas en el lado basal de las células. Mutantes para esta proteína muestran un fenotipo en el que la retina neural no se pliega y por tanto, no se forma la copa óptica (Martinez-Morales et al. 2009). Estos estudios sugieren una relación entre los cambios de forma, la adhesión de las células al sustrato y el plegamiento de la retina. En esta tesis analizamos de forma exhaustiva el comportamiento celular de la retina neural durante la morfogénesis de la copa óptica, usando el pez cebra como organismo modelo. Los resultados obtenidos de nuestro estudio confirman que la constricción basal que experimentan las células de la retina es el proceso principal que dirige la formación de la copa óptica. Para analizar el comportamiento de las células se han usado diferentes líneas transgénicas que marcan las membranas de las células de la retina u otros componentes celulares como la miosina. Con el fin de cuantificar las variaciones de área en las superficies apicales y basales de las células, realizamos películas de microscopia confocal in vivo y segmentamos las imágenes obtenidas. La segmentación permite identificar cada célula como una unidad y calcular diversos parámetros tales como el área o el perímetro. De entre los resultados obtenidos relacionados con los cambios de forma cabe destacar que entre 19 y 20hpf (hours post-fertilization del inglés), coincidiendo con el momento en el que se produce el máximo plegamiento (ver Figure 24), las células sufren una disminución significativa de área en la superficie basal. Esa disminución de área se produce tras sucesivas contracciones irreversibles de la membrana de forma similar al mecanismo de trinquete descrito en Drosophila (ver Figures 15 y 17). A continuación, entre 20 y 21hpf los neuroblastos incrementan su área en la superficie apical haciendo que las células adopten la forma cónica final (ver Figures 15 y 16). Con el fin de analizar si esas contracciones y relajaciones de la membrana ocurren simultáneamente en ambas superficies, se llevaron a cabo diferentes experimentos de trasplante de células procedentes de embriones transgénicos a embriones silvestres. Esto permite visualizar neuroblastos transgénicos de forma aislada.
Los datos obtenidos revelan que las contracciones de ambas superficies no están acopladas (ver Figure 18). Para esclarecer los mecanismos moleculares que producen estos cambios de forma en las células, realizamos películas in vivo con la línea transgénica que marca la miosina así como inyecciones del ARN de un marcador de actina llamado Utrophin. En el caso de la actina los resultados muestran una correlación positiva entre los cambios de área y la acumulación de actina en la superficie basal. Esto sugiere que la actina no contribuye de forma directa a la reducción de área celular (ver Figure 20). Para la miosina, esos análisis revelaron que durante el plegamiento de la copa óptica, la miosina se acumula en la superficie basal de las células en forma de pequeños focos que aparecen durante unos minutos. La presencia de esos focos en la célula se asocia a la disminución de área en la superficie basal y a acortamientos transitorios del eje apico-basal (ver Figures 21, 22 y 23). Estudios con la droga blebbistatin que interfiere con la actividad ATPasa de la miosina, muestran que en embriones tratados con este compuesto se inhibe el plegamiento de la copa óptica. Además, el blebbistatin incrementa la estabilidad de los focos de miosina en la superficie basal. Sin embargo, en presencia del inhibidor, estos focos de miosina no se asocian a reducciones de área ni al acortamiento del eje apico-basal como ocurre en el caso del silvestre (ver Figures 24 y 25). Estos resultados confirman que la miosina desempeña un papel fundamental en el desarrollo del ojo. En este trabajo también se abarca la relación de la adhesión a la matriz extracelular con el plegamiento. Para ello se utilizó un morfolino para la cadena γ de la laminina, que es el principal componente de la matriz. Las injecciones del morfolino produjeron embriones con un fenotipo en el ojo que se caracterizaba por la abertura ventral de la retina, el incremento de la longitud del eje apico-basal y mayor estabilidad de los focos de miosina (ver Figures 26, 27, 28). Nuevamente, este incremento en la estabilidad de los focos no está asociado a acortamientos del eje apico-basal (ver Figure 29). En conclusión, esta tesis propone que los cambios de forma celulares controlados por el mecanismo de trinquete son responsables del plegamiento de la copa óptica. Además, la localización basal de los focos de miosina y la correcta adhesión a la matriz extracelular a través de la Laminina son esenciales para el adecuado plegamiento de la retina durante el desarrollo del pez cebra.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/130365
Aparece en las colecciones: (CABD) Tesis
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