Caracterización del proteoma de las envolturas interna y externa de cloroplasto de Pisum sativum

Abstract

La envoltura cloroplástica ha sido poco estudiada desde el punto de vista proteómico por la alta hidrofobicidad de sus componentes protéicos. Hemos realizado un estudio de mapeo por electroforesis bidimensional (2DE) partiendo de extractos enriquecidos en proteínas de envoltura interna (lE) y externa (QE) de cloroplasto de Pisurn sativurn. Las muestras se cuantificaron por el método de Bradford y se solubilizaron en tampón Hippler antes de la focalización isoeléctrica (IEF). La primera dimensión (IEF) se realizó en tiras de 7 cm IPG (Bio-Rad) con un gradiente lineal de pH 3-10 para lE con 45 tg de proteína aplicada, mientras que para las muestras de QE se utilizó un gradiente lineal de pH 5-8 con 80 tg de proteína. Estos valores se determinaron por estudios preliminares. La segunda dimensión fue una electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Los geles fueron teñidos con Coomassie coloidal y analizados con el programa PDQuest 8.0. Se utilizaron dos réplicas biológicas para cada envoltura y se hicieron 4 geles de cada réplica. Se consideraron spots consistentes aquellos que aparecieron en los 8 geles correspondientes a cada muestra (lE 160 spot y QE 181 spots). Estos spots se sometieron a una digestión tríptica y se identificaron por MALDI-TQF. El porcentaje de identificación es bajo pero se han encontrado proteínas de interés que evidencian las funciones de la envoltura cloroplástica.