Análisis de los cambios en la fosforilación de proteínas inducidos por Acido Retinoico en células de Neuroblastoma

Abstract

El Acido Retinoico (RA), la forma activa de la vitamina A, induce en células de neuroblastoma SH-SY5Y la diferenciación neural. Los efectos del RA están mediados por su Receptor RAR, que pertenece a la superfamilia de los Receptores Nucleares de Hormonas. Además de sus acciones transcripcionales clásicas regulando la expresión de genes concretos, el RA actúa también de un modo extra-genómico, modulando la actividad de rutas de transducción de señal. El tratamiento con RA activa, entre otras la vía de señalización, PI3K/Akt, cuya activación por RA es un requisito para la diferenciación neural (López-Carballo G. et al., J. Biol. Chem. 277, 25297-25304, 2002). Estamos interesados en conocer cuáles son las dianas de estas acciones extra-genómicas del RA en células de neuroblastoma, y que influencia pueden tener sobre la respuesta transcripcional a RA. Para ello hemos iniciado un abordaje proteómico, basado en el hecho de que el resultado final de estas acciones extra-genómicas debe ser un cambio en los patrones de fosforilación de proteínas específicas. Para ello realizamos un enriquecimiento en proteínas fosforiladas a partir de extractos nucleares o celulares totales de células control y tratadas con RA, mediante cromatografía de afinidad. Estos extractos enriquecidos en proteínas fosforiladas son separados mediante electroforesis bidimensional (IEF/SDS-PAGE), y los geles son analizados y comparados informáticamente para identificar las bandas expresadas diferencialmente en ambas condiciones. Finalmente, las manchas identificadas son aisladas del gel, digeridas con tripsina y analizadas mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF y LC/MS/MS).