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Title

Efecto de la adición de lípidos a la dieta de ovejas lecheras sobre los microorganismos implicados en el metabolismo ruminal de los ácidos grasos y la regulación nutricional de la lipogénesis mamaria

Other TitlesEffect of the addition of lipids to the diet of dairy ewes on the microorganisms involved in rumen fatty acid metabolism and the nutritional regulation of mammary lipogenesis
AuthorsCastro Carrera, Tamara
AdvisorBelenguer, Álvaro ; Toral, Pablo G.
KeywordsLipid supplementation
Ruminal bacteria
Biohydrogenation
T-RFLP
Molecular biology
Lactating ewe
16S rDNA
qPCR
Pyrosequencing
Fatty acid composition
Lipogenic gene expression
Tissue
Issue Date2014
PublisherUniversidad de León
Abstract[EN] The growing incidence of diet-related chronic diseases and consumers’ concerns about food of animal origin has led to an increasing interest in developing healthier foods, much of it relating to milk and dairy products. Supplementation of ruminants’ diet with plant oils and marine lipids enables modulation of milk fatty acid (FA) composition towards a potentially healthier profile, lowering saturated FA content and increasing the concentration of some bioactive lipids. Although the mechanisms underlying this response seem to be mediated by alterations in ruminal and mammary lipid metabolism, the information available is very scant, in particular in dairy sheep. Thus, the relevance of specific microorganisms in ruminal FA metabolism and the effect of dietary lipids on the bacterial community structure remain largely unknown, and even less data are available on the nutritional regulation of mammary lipogenesis. In this regard, it could be hypothesized that the application of molecular biology techniques would allow a better understanding of the effects of nutrition on milk FA profile, which may be of great help in developing nutritional strategies to better control milk fat plasticity.
A series of four studies was therefore conducted in sheep with the aim of providing further insight into the microorganisms related to the metabolism of unsaturated FA in the rumen, as well as the mechanisms involved in the nutritional regulation of milk fat synthesis in the mammary gland. The first trial was carried out with lactating ewes to examine the effect of lipid addition on the rumen Butyrivibrio population, as well as time-dependent variations over an extended period. Although Butyrivibrio strains do not seem to have a dominant role in ruminal biohydrogenation in vivo, some yet-uncultured species within this group might be stimulated by lipid supplementation and be more relevant in this process. Thirty-six lactating ewes were divided in 6 lots and offered a diet rich in sunflower oil (2.5% DM) supplemented with 0 or 0.8% of marine algae (MA). After 0, 26 and 52 days on treatments, individual samples of rumen fluid were collected through a stomach tube, composited for each lot, and analysed using the terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)molecular technique.
Results showed no significant variations, due to either diet or time, in the Butyrivibrio profiles or in the relative abundances of the major terminal restriction fragments detected, which supports a low relevance of these bacteria in the ruminal FA metabolism in dairy sheep. However, the effect on some small subpopulations within this group (e. g., a fragment compatible with 18:0-producing bacteria) would not allow ruling out their involvement in the biohydrogenation process. Based on the results of the first experiment, the second trial was focused on the application of a high-throughput technology that may allow for a great coverage of rumen microbial diversity. Thus, in this experiment, 454 pyrosequencing was used, concurrently with T-RFLP, to assess the effect of diet supplementation with MA on the rumen bacterial community of dairy sheep. In addition, since ruminal cannulation is not really feasible in lactating sheep and stomach probe is often used to collect rumen fluid, a second objective was to investigate if samples of rumen fluid may be an alternative to those of whole rumen content to examine the effect of lipid supplementation on the bacterial community.
Eleven lactating ewes from the first study were then euthanized after 54 days on treatments (i. e., on diets supplemented or not with MA) and samples of rumen content and fluid were collected separately for microbial analysis. Pyrosequencing yielded a greater coverage of bacterial diversity than T-RFLP and allowed the identification of low abundant populations. Nevertheless, both molecular approaches pointed to similar conclusions and showed that relevant changes due to MA addition were observed within the major ruminal phyla, namely Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria. Decreases in the abundance of unclassified Bacteroidales, Porphyromonadaceae and Ruminococcaceae, and increases in as yet-uncultured species of the family Succinivibrionaceae, might be related to a potential role of these groups in different pathways of rumen FA metabolism. Diet supplementation with MA had, however, no effect on the relative abundance of Butyrivibrio and Pseudobutyrivibrio genera, in line with findings from the first trial. In addition, results from both 454 pyrosequencing and T-RFLP indicate that the impact of MA was rather consistent in rumen content or fluid samples, despite inherent differences between these fractions in their bacterial composition, which suggests that fluid samples may be a valid alternative to infer the effect of dietary lipids on bacterial structure and diversity.
The third study was aimed at designing a strategy to examine the ability of large oval bacteria identified as Quinella ovalis (QO) to metabolize unsaturated FA, which had been suggested in previous studies in ewes fed marine lipids. Four in vitro assays were conducted using cannulated sheep as rumen fluid donors. Animals received a diet supplemented with 1.8% of fish oil to favour the presence of QO, and rumen fluid was employed to obtain QO-enriched cell suspensions by differential centrifugation. Total bacteria and QO were counted by fluorescence in situ hybridization (FISH). In the first assay, the protocol of purification increased the proportion of QO over total bacteria from 2.6% in the rumen fluid to only 12.6% in the enriched suspension, which seemed unsufficient for a metabolic study. Thus, the objectives of the second and third assays were to improve the enrichment protocol and increase the percentage of QO through in vitro cultivation of the enriched cell suspensions. Selective cultures with mannitol as the sole substrate were conducted to stimulate growth of QO, but its abundance reached values of up to 42% of total bacteria after 6 h of incubation and dramatically decreased afterwards. In the fourth assay, an alternative strategy was proposed, consisting of the comparison of two cell suspensions with similar microbial structure but rich or depleted in QO through selective cultures with substrates that might favour (mannitol) or minimize (cellobiose and starch) its growth. However, this approach was not successful either. Overall, these results emphasize the great difficulty of designing culture-based strategies to study the metabolic features of QO.
Once these studies of microbiology were completed, a last experiment was conducted in order to investigate the response of the mammary gland, in terms of FA profile and mRNA abundance of genes involved in lipid metabolism, to a diet known to modify milk FA composition, as well as the possible contribution of adipose tissues to the regulation of mammary lipogenesis. Ten lactating ewes were randomly divided in two groups and fed a diet supplemented with 0 or 2.5% of sunflower oil. After 48 days on treatments, milk composition, including FA profile, was analysed. On day 49, the animals were euthanized and samples of the mammary and adipose (subcutaneous and perirenal) tissues were collected to analyse their FA profile and the mRNA abundance of 16 candidate genes. Feeding sunflower oil modified milk FA composition, with decreases in the concentration of FA derived from de novo synthesis (e. g., 12:0, 14:0 and 16:0) and increases in that of long chain FA (e. g., 18:0, cis-9 18:1, trans-18:1 isomers and cis-9, trans-11 CLA). However, these changes were not accompanied by significant variations in the mRNA abundance of studied lipogenic genes (i. e., ACACA, FASN, LPL, CD36, FABP3, SCD1 and SCD5) and transcription factors (SREBF1 and PPARG), or in the constituent FA of mammary tissue. Regarding adipose tissues, the little influence of sunflower oil on their FA profile did not appear to be linked to observed changes in gene mRNA abundance (i. e., decreases of GPAM and SREBF1 in both tissues, and of PPARG in the subcutaneous depot). Similarly, the great variation between adipose depots in FA composition could not be related to variations in gene mRNA abundance due to tissue site. Overall, these results suggest a marginal contribution of gene expression to the nutritional regulation of lipid metabolism in these tissues, at least with the examined diets and after 7 weeks on treatments. Nevertheless, it cannot be ruled out that the response to linoleic-rich diets is mediated by other genes or post-transcriptional mechanisms.
[ES] El aumento de la incidencia de enfermedades crónicas relacionadas con la dieta y la preocupación de los consumidores por los alimentos de origen animal han supuesto un estímulo para el desarrollo de productos más saludables, entre los que destacan la leche y sus derivados. La suplementación de la dieta de los rumiantes con aceites vegetales y lípidos de origen marino permite modificar la composición de los ácidos grasos (AG) de la leche y obtener un perfil potencialmente más saludable, reduciendo el contenido de AG saturados y aumentando el de algunos compuestos con propiedades bioactivas. Aunque los mecanismos que intervienen en esta respuesta parecen estar mediados por alteraciones en el metabolismo lipídico en el rumen y en la glándula mamaria, la información disponible al respecto es muy limitada, especialmente en las ovejas lecheras. Así, persiste un gran desconocimiento sobre los microorganismos responsables de la biohidrogenación ruminal de los AG y el efecto de los lípidos de la dieta sobre la estructura de la comunidad bacteriana, siendo esta información aún más escasa en lo referente a la regulación nutricional de la lipogénesis mamaria.
En este sentido, la aplicación de herramientas de biología molecular podría contribuir a esclarecer el efecto de la alimentación sobre la composición de AG de la leche, lo que sería de gran ayuda en el desarrollo de estrategias de alimentación que permitan modular de forma eficiente la plasticidad de la grasa láctea. Por ello, en esta tesis se llevaron a cabo cuatro pruebas experimentales en ovino con el objetivo de profundizar en el conocimiento de los microorganismos implicados en el metabolismo ruminal de los AG, así como los mecanismos que intervienen en la regulación nutricional de la síntesis de grasa en la glándula mamaria. La primera prueba se realizó con ovejas en lactación para investigar el efecto de la adición de lípidos sobre la población ruminal de Butyrivibrio, incluyendo las variaciones temporales durante un periodo de tiempo prolongado. Aunque las cepas cultivadas de Butyrivibrio no parecen tener un papel dominante en la biohidrogenación ruminal in vivo, es posible que especies filogenéticamente próximas pero que aún no han sido aisladas en cultivo pudieran verse estimuladas por la suplementación lipídica y ser más relevantes.
Treinta y seis ovejas en lactación se distribuyeron en 6 lotes y recibieron una dieta rica en aceite de girasol (2,5% MS) suplementada con 0 o 0,8% de microalgas marinas (MA). Tras 0, 26 y 52 días de tratamiento, se recogieron muestras individuales de fluido ruminal mediante el uso de sonda esofágica y, tras mezclarse para cada lote, se analizaron mediante la técnica molecular del polimorfismo de la longitud de los fragmentos terminales de restricción (T-RFLP). Ni la dieta ni el tiempo causaron cambios significativos en los perfiles de la población de Butyrivibrio o en las abundancias relativas de los principales fragmentos terminales de restricción, lo que concuerda con la baja relevancia de estas bacterias en el metabolismo ruminal de los AG en ovejas lecheras. Sin embargo, el efecto observado sobre algunas subpoblaciones poco abundantes de este grupo (e. g., sobre un fragmento compatible con bacterias productoras de 18:0) no permite descartar su implicación en el proceso de biohidrogenación. A partir de los resultados del primer experimento, la segunda prueba experimental se centró en la aplicación de una tecnología de alto rendimiento que permitiera abarcar una mayor diversidad microbiana en el rumen. Así, se empleó la técnica de pirosecuenciación 454, de forma simultánea a la T-RFLP, para evaluar el efecto de la suplementación de la dieta con MA sobre la comunidad bacteriana del rumen en ovino lechero. Además, como la canulación ruminal es poco factible en ovejas en lactación y se suele recurrir a la recogida de muestras de fluido mediante sonda esofágica, un segundo objetivo fue investigar si las muestras de fluido ruminal podrían ser una alternativa válida a las de contenido total para estudiar el impacto de la suplementación lipídica sobre la microbiota del rumen.
Para ello, se utilizaron 11 ovejas en lactación procedentes del primer estudio, que se sacrificaron mediante eutanasia tras 54 días de tratamiento con la dieta suplementada o no con MA, tomándose muestras independientes de contenido y fluido ruminal para los análisis de microbiología. Como cabía esperar, la pirosecuenciación permitió una mayor cobertura de la diversidad bacteriana que la T-RFLP y la identificación de poblaciones minoritarias. No obstante, ambas técnicas moleculares detectaron de forma similar las diferencias debidas a la adición de las MA, que se observaron principalmente en los filos mayoritarios del rumen (i. e., Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria). Los descensos en la abundancia de bacterias no clasificadas de Bacteroidales, Porphyromonadaceae y Ruminococcaceae, y los aumentos en especies no cultivadas de Succinivibrionaceae, podrían estar relacionados con un papel activo en diferentes rutas del metabolismo ruminal de los AG. Sin embargo, la suplementación con MA no alteró la abundancia relativa de los géneros Butyrivibrio y Pseudobutyrivibrio, lo que coincide con lo observado en la primera prueba. Además, los resultados de pirosecuenciación 454 y T-RFLP indican que, a pesar de las diferencias en la composición bacteriana del contenido y el fluido ruminal, el impacto de las MA es similar en ambas fracciones, lo que sugiere que las muestras obtenidas mediante sonda esofágica podrían ser una alternativa válida para inferir el efecto de los suplementos lipídicos sobre la estructura y diversidad bacterianas.
La tercera prueba experimental se planteó para diseñar una estrategia que permitiera examinar la implicación de bacterias grandes y ovaladas identificadas como Quinella ovalis (QO) en el metabolismo ruminal de los AG insaturados, hipótesis esta (la de la implicación) que había sido sugerida en estudios previos con ovejas alimentadas con lípidos marinos. Se realizaron 4 ensayos in vitro utilizando ovejas canuladas que recibieron una dieta suplementada con un 1,8% de aceite de pescado para favorecer la presencia de QO en el fluido ruminal, el cual se empleó para obtener suspensiones celulares enriquecidas en QO mediante centrifugación diferencial. Los recuentos de bacterias totales y QO se realizaron mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH). En el primer ensayo, el protocolo de enriquecimiento incrementó la proporción de QO respecto al total de bacterias desde el 2,6% en el fluido ruminal hasta el 12,6% en la suspensión enriquecida, lo que parecía insuficiente para un estudio de metabolismo. Por lo tanto, el segundo y tercer ensayo se plantearon para mejorar la efectividad del protocolo de enriquecimiento e incrementar aún más el porcentaje de QO a través de la incubación in vitro de las suspensiones celulares enriquecidas. Se realizaron cultivos selectivos con manitol como único sustrato para estimular el crecimiento de QO, pero su abundancia alcanzó valores de hasta el 42% de las bacterias totales tras 6 h de incubación y cayó de forma drástica a continuación. En el cuarto ensayo se planteó una estrategia alternativa que consistía en la comparación de dos suspensiones celulares con una estructura microbiana similar, pero una rica en QO y otra libre de esta bacteria, obtenidas mediante cultivo selectivo con sustratos que pudieran favorecer (manitol) o minimizar (celobiosa y almidón) su crecimiento. Sin embargo, este planteamiento tampoco fue satisfactorio. En conjunto, los resultados de esta prueba sobre QO ponen de manifiesto la complejidad para desarrollar un método basado en su cultivo que permita estudiar sus características metabólicas.
Además de estos estudios de microbiología, se llevó a cabo una última prueba experimental de nutrigenómica. Su principal objetivo fue investigar la respuesta de la glándula mamaria, en términos de composición de AG y abundancia del ARNm de genes implicados en el metabolismo lipídico, a una dieta que modifica el perfil de AG de la leche. Un segundo objetivo consistió en estudiar la posible contribución de los tejidos adiposos a la regulación de la lipogénesis mamaria. Se utilizaron 10 ovejas en lactación que fueron distribuidas en 2 grupos y alimentadas con una dieta suplementada con 0 o 2,5% de aceite de girasol. Tras 48 días de tratamiento, se analizó la composición de la leche, incluyendo su perfil lipídico. El día 49, los animales se sacrificaron mediante eutanasia y se recogieron muestras de tejidos mamario y adiposo (subcutáneo y perirrenal) para examinar su perfil de AG y la abundancia del ARNm de 16 genes candidatos. La suplementación de la dieta con aceite de girasol modificó la composición lipídica de la leche, disminuyendo la concentración de AG derivados de la síntesis de novo (e. g., 12:0, 14:0 y 16:0) y aumentando la de AG de cadena larga (e. g., 18:0, cis-9 18:1, isómeros trans-18:1 y cis-9, trans-11 CLA). Sin embargo, esta respuesta no se vio acompañada ni de cambios significativos en la abundancia del ARNm de los genes de la lipogénesis (i. e., ACACA, FASN, LPL, CD36, FABP3, SCD1 y SCD5) o de los factores de transcripción (SREBF1 y PPARG) que se estudiaron, ni de diferencias en los AG constituyentes del tejido mamario.
Respecto a los tejidos adiposos, la escasa influencia del aceite de girasol sobre su perfil lipídico no pareció estar relacionada con variaciones en la abundancia del ARNm (i. e., descensos de GPAM y SREBF1 en ambos depósitos y de PPARG en el subcutáneo). De forma similar, las grandes diferencias en la composición de AG entre ambos tejidos adiposos no se asociaron a cambios en la abundancia del ARNm de los genes analizados. En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión génica podría tener una contribución marginal a la regulación nutricional del metabolismo lipídico en estos tejidos, al menos con las dietas examinadas y tras 7 semanas de tratamiento. Sin embargo, no se puede descartar que los efectos del aceite de girasol estén mediados por cambios en otros genes o por mecanismos postranscripcionales.
DescriptionTesis doctoral de la Universidad de León-Instituto de Ganadería de Montaña (IGM-ULE), 2014.-- Fecha de lectura:2015-02-26.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/113278
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